ULBPs的免疫識別機(jī)制、其剪切變體的功能以及相關(guān)的腫瘤免疫逃逸機(jī)制的研究.pdf

1、近幾年來，ULBPs(又稱為RAET1分子)作為一類新發(fā)現(xiàn)的人NKG2D配體家族日益受到關(guān)注。該基因家族業(yè)已報道的成員有ULBP1(RAET1I)、ULBP2(RAET1H)、ULBP3(RAET1N)、ULBP4(RAET1E)和ULBP5(RAET1G)。ULBPs可表達(dá)于多種腫瘤細(xì)胞的表面，不僅是NKG2D的功能性配體，而且還可以通過TCRγδ1途徑直接激活γδT細(xì)胞，并在抗腫瘤的免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要的作用。 一、利用先期M

2、ICA和γδT細(xì)胞研究的工作基礎(chǔ)，就ULBPs激活γδT細(xì)胞的抗腫瘤作用及其免疫識別機(jī)制開展研究。通過人類ULBPs基因克隆與重組蛋白的表達(dá)、ULBPs單克隆抗體制備等基礎(chǔ)性工作，建立ULBPs體外擴(kuò)增γδT細(xì)胞的方法，并觀察其對腫瘤細(xì)胞的特異性細(xì)胞毒作用；同時開展對ULBPs反應(yīng)性γδ T細(xì)胞的CDR3區(qū)序列分析、TCR和NKG2D在γδT細(xì)胞免疫識別和活化中的關(guān)系分析等研究，為ULBPs類新分子的抗腫瘤作用和其免疫識別機(jī)制研究以及γ

3、δT細(xì)胞過繼免疫治療腫瘤的新策略奠定理論和實(shí)驗基礎(chǔ)。 1.從人紅白血病細(xì)胞系K562、人宮頸癌細(xì)胞系Hela、人漿液性卵巢腺癌細(xì)胞系HO-8910中提取總RNA，通過RT-PCR技術(shù)分別克隆了ULBP1、RAET1G和RAET1G2；ULBP2和ULBP3；ULBP4的全長cDNA。利用pET原核表達(dá)系統(tǒng)重組表達(dá)了ULBPs家族的所有成員；此外，還利用pcDNA<'TM>3.1/myc.His(-)A真核表達(dá)載體系統(tǒng)在CHO中國

4、倉鼠卵巢細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)全長的ULBPs基因家族，同時還分泌表達(dá)了ULBP3的胞外功能域，這些系統(tǒng)的建立為后續(xù)研究奠定了基礎(chǔ)。 2.分別利用原核表達(dá)的重組ULBP4和RAET1G2蛋白制備了特異性單克隆抗體。通過ELISA、間接免疫熒光、流式細(xì)胞儀和Westem blot等技術(shù)對單克隆抗體進(jìn)行了特異性鑒定。這些抗體的獲得為進(jìn)一步的研究提供了有力的工具。 3.對ULBPs家族中的ULBP3成員進(jìn)行了初步的研究。在實(shí)驗的早期階

5、段，由于未能獲得腫瘤患者的外周血或腫瘤組織，故對健康人的外周血進(jìn)行了嘗試。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：ULBP3在體外不僅能刺激健康人外周血NK細(xì)胞的增殖(54.7％VS 9.9％)，還能刺激γδT細(xì)胞的增殖(15.3％VS 2.7％)?？紤]到擴(kuò)增γδ T細(xì)胞的效率較低，直接做功能研究需要大量的PBMC并進(jìn)行流式分選，因而采用折中的研究策略——即直接對其CDR3區(qū)序列進(jìn)行分析。 二、鑒定所發(fā)現(xiàn)的ULBPs剪切變體的功能——即是否都是人NKG2D的

6、功能性配體?在克隆ULBPs基因家族的過程中意外地發(fā)現(xiàn)ULBP4的三個剪切變體(ULBP4-Ⅰ、ULBP4-Ⅱ和ULBP4-Ⅲ)和RAET1G2的一個剪切變體(RAET1G3)，盡管這些變體的發(fā)生頻率比較低(<5％)。氨基酸序列分析顯示：這些變體與其各自的父本序列比較有小片段氨基酸的缺失或插入。功能研究顯示：轉(zhuǎn)染了ULBP4各剪切變體的Raji細(xì)胞和CHO細(xì)胞都能被NKG2D-hIgG1Fc段融合蛋白所識別；此外，和游離性的RAET1G

7、2一樣，ULBP4各剪切變體的胞外段功能域蛋白以及RAET1G3與NK-92細(xì)胞共育后都能下調(diào)后者NKG2D的表達(dá)，從另一方面也證明了它們都是人NKG2D的功能性配體；最后，原核表達(dá)的RAET1G3重組蛋白還能刺激NK-92細(xì)胞分泌IFN-γ。綜合以上的實(shí)驗結(jié)果，證明所發(fā)現(xiàn)的這些ULBPs剪切變體都是人NKG2D的功能性配體，這一結(jié)果提示人NKG2D受體對其配體的識別具有很強(qiáng)的可塑性；同時，這一發(fā)現(xiàn)將有助于我們更加全面地了解ULBPs基

8、因家族。 三、分析ULBPs中含跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)的膜蛋白亞家族成員RAET1E(即ULBP4)是否參與了腫瘤逃逸以及其逃逸機(jī)制如何?首先，我們在克隆RAET1E基因的過程中克隆到了其截短的不含跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)的基因(我們命名為RAET1E2)，并且在蛋白質(zhì)水平證明了該截短基因的存在。其次，功能研究顯示：RAET1E2陽性的腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清、RAET1E2基因轉(zhuǎn)染的COS-7細(xì)胞培養(yǎng)上清以及RAET1E2重組表達(dá)蛋白與NK-92細(xì)胞共

9、育后都能明顯下調(diào)后者NKG2D的表達(dá)，而且NK-92細(xì)胞在其NKG2D下調(diào)表達(dá)之后對多種靶細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用明顯下降。綜合以上的實(shí)驗結(jié)果，除了已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的在蛋白水平的脫落所介導(dǎo)的免疫逃逸機(jī)制(例如MICA和ULBP2)，我們首次發(fā)現(xiàn)了：ULBPs在RNA水平的選擇性剪切能生成截短的不含跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)的可溶性的蛋白，從而介導(dǎo)某些腫瘤的免疫逃逸，這一發(fā)現(xiàn)豐富了我們對腫瘤免疫逃逸機(jī)制的認(rèn)識，進(jìn)而為腫瘤逃逸的免疫干預(yù)提供新的信息和更多的靶點(diǎn)。

10、 四、人外周血γδT細(xì)胞體外擴(kuò)增方法的建立，該技術(shù)方法的建立與改進(jìn)將為以后的實(shí)驗研究提供有力的工具。 綜上所述，本文具有以下幾個創(chuàng)新點(diǎn)：1.開展TCR-δ1-CDR3區(qū)的結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究，發(fā)現(xiàn)了ULBP3反應(yīng)性的δ1主型序列，其CDR3區(qū)序列如下：CAL,GELGSYLYWGIRYTDKLIFGKG，共25個氨基酸，具有完整的Vδ1、D3和Jδ1胚系基因片斷，為深入了解TCR δ1-CDR3區(qū)在免疫識別中所起的作用提供了必要的