低剪切力介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)膜型基質(zhì)金屬蛋白酶1的機(jī)制及辛伐他汀干預(yù)的研究.pdf

1、背景: 動脈粥樣硬化致病機(jī)理一直是心血管領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，先后有血栓形成學(xué)說、炎癥學(xué)說、脂質(zhì)浸潤學(xué)說、單克隆學(xué)說、損傷反應(yīng)學(xué)說、氧化學(xué)說、同型半胱氨酸學(xué)說以及精氨酸學(xué)說。Pober和Cotran在大量血流動力學(xué)與動脈粥樣硬化關(guān)系的研究成果基礎(chǔ)上，提出了動脈粥樣硬化發(fā)病學(xué)的剪切力學(xué)說（shear stress hypothesis），認(rèn)為血流剪切力異常是促使動脈粥樣硬化病變形成的重要原因之一。 根據(jù)血管內(nèi)皮細(xì)胞精細(xì)調(diào)節(jié)多種“

2、血管保護(hù)”效應(yīng)分子的反應(yīng)能力和流體機(jī)械力調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞基因表達(dá)的潛能，剪切力學(xué)說認(rèn)為，均勻的層流剪切力可選擇性地誘導(dǎo)內(nèi)皮“動脈粥樣硬化保護(hù)性基因”的表達(dá)，從而作用于局部以抵消全身性危險(xiǎn)因素的有害作用。血流動力學(xué)因素異常出現(xiàn)層流剪切力不均勻，內(nèi)皮細(xì)胞分泌抗動脈粥樣硬化分子減少，高膽固醇血癥、高半胱氨酸血癥等危險(xiǎn)因素的持續(xù)作用可促使動脈粥樣硬化病變的發(fā)生。顯然，動脈粥樣硬化灶性分布特點(diǎn)主要由血流動力學(xué)因素介導(dǎo)的血管易損性程度所決定。該定位分布

3、特點(diǎn)在人體和實(shí)驗(yàn)動物均已得到證實(shí)，這有力地說明剪切力與動脈粥樣硬化病變發(fā)生部位的緊密關(guān)系。研究表明人的動脈管壁處于生理剪切力區(qū)域（剪切力≥l2dyne/c㎡）有抑制動脈粥樣硬化形成的保護(hù)性作用，而低剪切力區(qū)域（剪切力≤4dyne/c㎡）有促動脈粥樣硬化形成作用。 膜型基質(zhì)金屬蛋白酶1（membrane type-1 matrix metalloproteinase，MT1-MMP，MMP-14）是唯一錨定于細(xì)胞膜上的膠原蛋白酶，

4、其底物廣泛包括：膠原，纖連蛋白，層連蛋白，彈性蛋白，纖溶酶原等。實(shí)驗(yàn)表明MT1-MMP可以通過促進(jìn)單核細(xì)胞遷移、降解細(xì)胞外基質(zhì)包括膠原等，促進(jìn)易損斑塊的發(fā)生和發(fā)展。新近實(shí)驗(yàn)通過選擇性基因敲除和過表達(dá)兩個(gè)方面證實(shí)，MT1-MMP通過影響斑塊膠原纖維含量在易損斑塊的形成過程中起到重要作用。 已有實(shí)驗(yàn)證實(shí)，低剪切力可以上調(diào)MMP-2和MMP-9的表達(dá)，同時(shí)增加其活性，MT1-MMP可以通過活化MMP-2和MMP-9前膠原形式增加其活性

5、。然而，低剪切力與MT1-MMP的關(guān)系尚未明了。因此我們提出了這樣的假設(shè)：低剪切力可誘導(dǎo)MT1-MMP的表達(dá)，從而參與動脈粥樣硬化斑塊的形成。 研究目的： 1.在低剪切力動物模型中，觀察低剪切力對MT1-MMP的作用。 2.在體外細(xì)胞研究中，明確低剪切力與MT1-MMP的關(guān)系。 研究方法: 1.動物模型 20只8～10周齡雄性ApoE-/-小鼠，均給予高脂飲食（含0.25％膽固醇和15％脂

6、肪）喂養(yǎng)。通過縮窄性頸總動脈套管建立ApoE-/-小鼠左側(cè)頸總動脈低剪切力動脈粥樣硬化斑塊模型，右側(cè)頸總動脈假手術(shù)對照。 2.顯微超聲測量 應(yīng)用顯微超聲技術(shù)測量小鼠左側(cè)和右側(cè)頸總動脈最大內(nèi)膜中層厚度（IMT），收縮期內(nèi)徑（Ds），近心端最大血流速度（Vmax）。根據(jù)公式τ（N/㎡）=4·Vmax·η/Ds，η是血液粘滯系數(shù)（采用η=0.035）計(jì)算小鼠左右兩側(cè)頸總動脈剪切力（τ）。 3.病理學(xué)檢測 8周末

7、應(yīng)用過量戊巴比妥鈉注射使小鼠安樂死后，PBS液體灌洗血管，繼之灌注4％的多聚甲醛固定液。分離左側(cè)頸總動脈和右側(cè)頸總動脈，取材后標(biāo)本置于4％的多聚甲醛固定液中浸泡固定12小時(shí)，OCT包埋，制作5um冰凍切片，標(biāo)本每間隔50 um即連續(xù)切片20張，蘇木素-伊紅染色。其它相鄰切片做免疫組化檢測MT1-MMP的分布和含量。 4.體外人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)及鑒定 4.1人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的原代培養(yǎng)與傳代 無菌獲取剖宮產(chǎn)新生兒臍

8、帶15-20cm，沖洗臍靜脈管腔。將臍帶另一端用止血鉗夾閉，注入胰酶于超凈臺上室溫消化5-7 min。將胰酶抽出，置于離心管內(nèi)，再沖洗管腔，洗出液置于離心管內(nèi)，加入胎牛血清終止消化。離心10min，于超凈臺上將離心管內(nèi)的上清液倒掉，以全培養(yǎng)基將細(xì)胞重新懸浮，轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶內(nèi)，置于孵箱中培養(yǎng)，12-24h后換液，清除未貼壁細(xì)胞。 4.2傳代 待原代細(xì)胞融合成單層后，用PBS將細(xì)胞洗兩遍，以去除血清，加入0.25％胰酶2 ml

9、，孵箱內(nèi)消化3-5min，在倒置相差顯微鏡下觀察見細(xì)胞變成圓形，吸出胰酶，加入培養(yǎng)基，輕輕吹打，待細(xì)胞全部懸浮，按105個(gè)/ml分裝，放回37℃孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)。 4.3內(nèi)皮細(xì)胞鑒定 免疫熒光法檢測CD31、CD34和Ⅷ因子：HUVECs接種于預(yù)先置于細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)的蓋玻片上，至細(xì)胞長成單層，棄培養(yǎng)液，PBS洗3次，加入95％乙醇固定30min，PBS沖洗，采用免疫熒光染色，滴加相應(yīng)抗體血清，再滴加1：40熒光素標(biāo)記的羊抗兔

10、疫熒光抗體，設(shè)陰性及空白對照。熒光顯微鏡下觀察、拍片。 5.內(nèi)皮細(xì)胞剪切力干預(yù)分組 5.1不同作用時(shí)間下，低剪切力對臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)MT1-MMP mRNA及蛋白質(zhì)活性的影響 1）靜態(tài)對照組：不給予剪切力，細(xì)胞在靜態(tài)下培養(yǎng)。 2）低剪切力1小時(shí)組：給予低剪切力（4 dyne/c㎡）作用1小時(shí)，以觀察MT1-MMP mRNA及蛋白質(zhì)活性的變化。 3）低剪切力3小時(shí)組：給予低剪切力（4 dyne/c

11、㎡）作用3小時(shí)，以觀察MT1-MMP mRNA及蛋白質(zhì)活性的變化。 4）低剪切力5小時(shí)組：給予低剪切力（4 dyne/c㎡）作用5小時(shí)，以觀察MT1-MMP mRNA及蛋白質(zhì)活性的變化。 5.2相同作用時(shí)間下，不同剪切力對臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)MT1-MMP mRNA及其蛋白質(zhì)活性的影響 1）靜態(tài)對照組：細(xì)胞不給予任何剪切力。 2）低剪切力組：給予低剪切力（4 dyne/c㎡2）分別作用1、3、5小時(shí)，觀察低

12、剪切力對MT1-MMP mRNA及蛋白質(zhì)活性的影響。 3）生理剪切力組：給予生理性剪切力（12 dyne/c㎡）分別作用1、3、5小時(shí)，觀察低剪切力對MT1-MMP mRNA及蛋白質(zhì)活性的影響。 6.實(shí)時(shí)定量RT-PCR 根據(jù)試劑盒說明，以Trizol自HUVECs中提取總RNA。用M-MLV試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。于Light Cycler上實(shí)行實(shí)時(shí)定量PCR。每個(gè)樣本重復(fù)三次測量。MT1-MMP擴(kuò)增引物：上游5'-

13、ACGTGCAGCAGCATTGGA-3'，下游5'-CAACAGGAGCAAGTGTGCCTTC-3'；β-actin擴(kuò)增引物，上游5'-TGGACATCCGCAAAGAC-3'，下游5'-GAAAGGGTGTAACGCAACTA-3'。反應(yīng)結(jié)束得到循環(huán)閾值（Ct值），用相對定量的方法（2-△△Ct）來分析數(shù)據(jù)。MT1-MMP mRNA表達(dá)以管家基因β-actin進(jìn)行標(biāo)化。 7.Western Blot分析 收集細(xì)胞后

14、，提取總蛋白，煮沸5分鐘。以SDS-PAGE電泳，然后轉(zhuǎn)膜，封閉，洗膜三次。以適當(dāng)濃度的一抗4℃過夜后，洗膜。二抗孵育、洗膜，最后采用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法觀察結(jié)果。 8.MT1-MMP活性測定 收集細(xì)胞后，加入適量蛋白提取液，收集上清液待查。吸取待測蛋白以及蛋白標(biāo)準(zhǔn)品加入96孔板中，輕輕搖晃20s，4℃孵育過夜。洗板4次，每孔滴加結(jié)合液50ul，混勻，滴加50ul反應(yīng)試劑，搖晃20s混勻，在405nm讀取t0值。37℃孵育2.

15、5h，搖晃20s，405nm讀取t值。由標(biāo)準(zhǔn)品濃度根據(jù)濃度和（t-t0）×1000/6.25呈線性關(guān)系描繪標(biāo)準(zhǔn)曲線，由標(biāo)準(zhǔn)曲線得出待測值。 9.統(tǒng)計(jì)分析 實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。應(yīng)用SPSS13.0軟件進(jìn)行分析，兩兩比較采用t檢驗(yàn)，多組之間采用單因素方差分析，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)論： 1.在ApoE-/-小鼠低剪切力模型中，低剪切力可以上調(diào)MT1-MMP的表達(dá)。 2.在體外研