血型B抗原模擬多肽-Fas重組腺病毒對(duì)小鼠4T1乳腺癌影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景：
　　 機(jī)體的免疫系統(tǒng)具有控制腫瘤發(fā)生發(fā)展的能力，是腫瘤研究中最古老的概念之一。其中腫瘤微環(huán)境的免疫狀態(tài)在腫瘤發(fā)生學(xué)及治療方面又具有至關(guān)重要的作用。隨著科學(xué)技術(shù)和方法學(xué)的進(jìn)步，越來越多的腫瘤抗原被鑒定出來。研究者發(fā)現(xiàn)，雖然很多腫瘤抗原的免疫原性不弱，而且抗原提呈細(xì)胞可迅速呈遞大多數(shù)腫瘤抗原，腫瘤患者體內(nèi)也確實(shí)存在針對(duì)腫瘤抗原所產(chǎn)生的免疫應(yīng)答，但相關(guān)免疫應(yīng)答產(chǎn)物并不能產(chǎn)生有效的抗腫瘤效應(yīng)。當(dāng)前多數(shù)免疫治療方法均能夠增強(qiáng)患

2、者全身的免疫功能，但抗瘤效果卻與預(yù)期的相差很多。原因主要在于腫瘤患者免疫功能狀態(tài)并不能直接反應(yīng)機(jī)體的抗腫瘤免疫效應(yīng)，即使患者全身免疫功能得到改善，腫瘤微環(huán)境內(nèi)的免疫效應(yīng)卻仍處于抑制狀態(tài)。腫瘤微環(huán)境是腫瘤細(xì)胞發(fā)生發(fā)展過程中所處的內(nèi)環(huán)境，由腫瘤細(xì)胞本身、間質(zhì)細(xì)胞、微血管、組織液及少量浸潤細(xì)胞，如樹突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等共同組成。作為腫瘤免疫效應(yīng)階段的執(zhí)行場所，腫瘤微環(huán)境內(nèi)存在多種因素均與局部免疫抑制狀態(tài)的產(chǎn)生有關(guān)，并形成了腫瘤局部微環(huán)境中特有

3、免疫模式。腫瘤細(xì)胞不僅逃避免疫系統(tǒng)的攻擊，同時(shí)也抑制其生長環(huán)境中的免疫細(xì)胞的正常功能。這些因素為開辟新的腫瘤免疫治療方案提供了思路。
　　 隨著分子生物醫(yī)學(xué)的發(fā)展，免疫治療作為腫瘤第四種治療模式-生物治療的重要組成部分，在腫瘤治療中的地位和作用日趨重要。逆轉(zhuǎn)腫瘤微環(huán)境的免疫抑制狀態(tài)是當(dāng)前腫瘤免疫治療的難題與突破點(diǎn)。
　　 研究目的：
　　 應(yīng)用健康成人B型血全血腹腔注射免疫BALB/c小鼠使其體內(nèi)產(chǎn)生抗血型抗原B

4、抗體;構(gòu)建BALB/c小鼠4T1乳腺癌荷瘤模型;在BALB/c小鼠荷瘤模型中瘤內(nèi)注射血型B抗原模擬多肽/Fas重組腺病毒，測定其在腫瘤組織中的表達(dá)情況，觀察其對(duì)人紅細(xì)胞懸液免疫后的小鼠腫瘤生長的抑制作用及對(duì)生存期的影響;測定瘤內(nèi)注射重組病毒后小鼠腫瘤微環(huán)境淋巴細(xì)胞、TNF-α、IFN-γ、IL-2、微血管密度等免疫功能指標(biāo)，判定其對(duì)腫瘤微環(huán)境免疫抑制狀態(tài)的逆轉(zhuǎn)作用。
　　 實(shí)驗(yàn)方法：
　　 1、將健康成人全血稀釋成不同濃

5、度紅細(xì)胞懸液，腹腔注射免疫BALB/c小鼠，每次0.2ml，2次/周，免疫后3天、7天、14天、21天、28天，分別測定小鼠體內(nèi)產(chǎn)生抗血型抗原B抗體效價(jià)，擇優(yōu)選擇最適宜的紅細(xì)胞懸液免疫濃度，分析抗體產(chǎn)生的趨勢，為后續(xù)試驗(yàn)做準(zhǔn)備;
　　 2、無菌環(huán)境下培養(yǎng)4T1乳腺癌細(xì)胞，至對(duì)數(shù)生長期，制備細(xì)胞懸液(濃度為106/ml)，小鼠乳腺脂肪墊區(qū)皮下注射上述濃度4T1乳腺癌細(xì)胞0.2ml。7天左右，腫瘤長至1cm左右大小，選取腫瘤無出血壞

6、死的小鼠進(jìn)一步實(shí)驗(yàn);
　　 3、選取腫瘤大小相近、腫瘤無出血壞死的18只荷瘤小鼠，隨機(jī)分3組，分別瘤內(nèi)注射重組腺病毒Ad-P(1)/Fas(效價(jià)為7×1010pfu/mL)、空腺病毒(效價(jià)為2.21×1011pfu/mL)、0.9％NaCL0.1ml，連續(xù)注射3天。注射后第10天處死三組小鼠，取出腫瘤組織，應(yīng)用westernblot方法測定B/Fas在腫瘤組織中的表達(dá)情況。流式細(xì)胞儀檢查腫瘤內(nèi)淋巴細(xì)胞的變化、ELISA法測定TN

7、F-α、IFN-γ、IL-2含量、免疫組織化學(xué)法檢測CD34表達(dá)，并判定其對(duì)腫瘤微環(huán)境免疫抑制狀態(tài)的逆轉(zhuǎn)作用;
　　 4、36只荷瘤小鼠，分三組，每組12只，每組隨機(jī)取5只小鼠應(yīng)用游標(biāo)卡尺測量三組小鼠腫瘤長徑a和垂直寬徑b，比較注射前、注射后3天、7天、14天三組小鼠腫瘤體積變化，并觀察所有荷瘤小鼠的生存期，設(shè)定觀察期限為60天。腫瘤體積計(jì)算方法如下:V(cm3)=1/2a×b2。觀察不同處理對(duì)小鼠腫瘤生長的抑制作用及對(duì)生存期的

8、影響。
　　 5、統(tǒng)計(jì)方法
　　 (1)計(jì)量資料結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示;
　　 (2)不同分組不同時(shí)間抗血型抗原B抗體效價(jià)、目的蛋白B/Fas的表達(dá)量灰度值、腫瘤體積比較應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件包采用重復(fù)測量數(shù)據(jù)的方差分析比較，不同時(shí)間點(diǎn)各處理組間抗血型抗原B抗體效價(jià)、目的蛋白B/Fas的表達(dá)量灰度值、腫瘤體積、腫瘤內(nèi)淋巴細(xì)胞亞群、細(xì)胞因子的測定、腫瘤內(nèi)微血管密度比較應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件包采用one-

9、wayANOVA方法分析及組間比較采用LSD法，如方差不齊則選擇近似F檢驗(yàn)Welch法，及Dunnett'sT3組間比較。以P＜0.05為差異有顯著性。
　　 (3)各組小鼠生存期間應(yīng)用Kaplan-Meier法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)。組間比較采用Logrank法。以P＜0.05為差異有顯著性。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　 1、成功應(yīng)用健康成人B型紅細(xì)胞懸液誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生抗血型B抗原抗體，不同濃度紅細(xì)胞懸液之間的免疫作用無統(tǒng)計(jì)

10、學(xué)差異(F=1.871，P=0.196)，免疫后14天、21天抗體效價(jià)值達(dá)最高。
　　 2、瘤內(nèi)注射B/Fas重組腺病毒后3天、注射后7天、注射后10天、注射后14天，目的蛋白B/Fas均可在腫瘤組織中穩(wěn)定表達(dá)，且不同時(shí)間點(diǎn)表達(dá)量有顯著差異(F=36.322，P＜0.001)，以瘤內(nèi)注射后7-10天左右表達(dá)量最高。
　　 3、分別應(yīng)用瘤內(nèi)注射B/Fas重組腺病毒、空腺病毒、生理鹽水處理經(jīng)紅細(xì)胞懸液免疫的小鼠，不同組間腫瘤

11、體積變化比較具有顯著差異(F=18.16，P＜0.001)。注射前、注射后3天、7天、14天不同時(shí)間點(diǎn)小鼠腫瘤體積變化比較具有顯著差異(F=129.291，P＜0.001)。
　　 4、瘤內(nèi)注射B/Fas重組腺病毒、空腺病毒、生理鹽水后三組荷瘤小鼠的生存期無顯著性差異(P=0.154)。
　　 5、小鼠腫瘤組織病理切片示人紅細(xì)胞懸液免疫后瘤內(nèi)注射血型B抗原模擬多肽/Fas重組腺病毒10天后可使腫瘤細(xì)胞壞死及炎癥細(xì)胞的浸潤

12、明顯增加，對(duì)照組效果欠佳。
　　 6、瘤內(nèi)注射血型B抗原模擬多肽/Fas重組腺病毒、瘤內(nèi)注射空腺病毒、瘤內(nèi)注射生理鹽水處理后10天，小鼠腫瘤組織內(nèi)CD3+淋巴細(xì)胞、CD4+淋巴細(xì)胞、CD8+淋巴細(xì)胞、CD4+CD25+淋巴細(xì)胞的比例在不同組間的比較有顯著性差異(F=104.835,P＜0.001;F=150.153,P＜0.001;F=48.494,P＜0.001;F=65.823,P＜0.001)。瘤內(nèi)注射血型B抗原模擬多肽/

13、Fas重組腺病毒可明顯增加小鼠腫瘤組織內(nèi)CD3+淋巴細(xì)胞、CD4+淋巴細(xì)胞、CD8+淋巴細(xì)胞亞群的比例，并減少CD4+CD25+淋巴細(xì)胞的比例。
　　 7、瘤內(nèi)注射血型B抗原模擬多肽/Fas重組腺病毒、空腺病毒、生理鹽水不同處理后10天，不同組間腫瘤內(nèi)TNF-α、IFN-γ、IL-2變化的比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=16.418,P＜0.001;F=94.032,P＜0.001;F=69.848,P＜0.001)。不同組間多重比較示

14、，瘤內(nèi)注射B/Fas重組腺病毒可較對(duì)照組明顯增加腫瘤組織內(nèi)TNF-α、IFN-γ、IL-2含量，增強(qiáng)局部抗腫瘤效應(yīng)。
　　 8、瘤內(nèi)注射血型B抗原模擬多肽/Fas重組腺病毒、空腺病毒、生理鹽水不同處理后10天，瘤內(nèi)注射B/Fas重組腺病毒與瘤內(nèi)注射空腺病毒或生理鹽水組間微血管數(shù)量的比較均有顯著性差異(P=0.001，P=0.003)，而瘤內(nèi)注射空腺病毒與瘤內(nèi)注射生理鹽水組比較則差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.724)。瘤內(nèi)注射重組腺病

15、毒較對(duì)照組可明顯減少腫瘤內(nèi)微血管的數(shù)量。
　　 結(jié)論：
　　 重組腺病毒載體感染后，B/Fas融合蛋白在小鼠腫瘤組織中高效表達(dá);經(jīng)健康成人B型血紅細(xì)胞懸液腹腔注射免疫后小鼠體內(nèi)可產(chǎn)生有效的抗血型B抗原抗體;紅細(xì)胞懸液免疫后的BALB/c小鼠經(jīng)瘤內(nèi)注射B/Fas重組腺病毒處理可明顯抑制4T1乳腺癌的生長，與其他組的生存期比較無區(qū)別。與對(duì)照組比較，瘤內(nèi)注射血型B抗原模擬多肽/Fas重組腺病毒可明顯增加腫瘤組織內(nèi)效應(yīng)淋巴細(xì)胞的