殼聚糖神經(jīng)導(dǎo)管及其復(fù)合骨髓間充質(zhì)干細胞修復(fù)大鼠周圍神經(jīng)損傷的研究.pdf

1、殼聚糖是由2—氨基—2—脫氧—β—D—葡萄糖通過β—1，4糖苷鍵聚合的一種天然聚陽離子生物多糖，在體內(nèi)可被降解為氨基葡萄糖，被人體吸收，具有優(yōu)良的生物相容性和生物可降解性，是理想的細胞外基質(zhì)材料，從而使殼聚糖及其衍生物被廣泛地應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。目前已利用殼聚糖成功地開發(fā)出人造皮膚、人造腎膜等產(chǎn)品，在作為神經(jīng)、肌腱、骨骼、牙齒等器官的修復(fù)材料和作為培養(yǎng)肝、腎等人工器官的支架材料的研究中也都表現(xiàn)出廣泛的應(yīng)用前景。隨著生產(chǎn)機械化程度的提高和

2、交通事業(yè)的發(fā)展，周圍神經(jīng)損傷的發(fā)生率呈大幅度上升趨勢，在我國這類神經(jīng)損傷每年約發(fā)生200萬例，目前通常運用顯微外科技術(shù)對周圍神經(jīng)短距離缺損的離斷傷進行端對端的外膜縫合，但是大于5mm的斷損神經(jīng)無法直接縫合，取其他部位的神經(jīng)移植又會造成新的功能缺失，因此一直是神經(jīng)外科領(lǐng)域中的難題。利用組織工程進行修復(fù)將是一種有效的手段，但需要在神經(jīng)導(dǎo)管材料的選擇，設(shè)計制作及種子細胞等多方面開展系統(tǒng)研究。本研究主要內(nèi)容包括： ⑴殼聚糖用作周圍神經(jīng)損

3、傷修復(fù)材料的性質(zhì)研究。在體外研究了不同分子量和脫乙酰度的殼聚糖的降解性，親水性，與雪旺細胞和骨髓間充質(zhì)干細胞的細胞親和性。結(jié)果表明，分子量為50kD、200kD，脫乙酰度為85％的殼聚糖降解較快，六周達到50％與40％，親水性較差，且細胞親和性較低，而分子量為500kD、1000kD，脫乙酰度為95％的殼聚糖降解較慢，六周達到分別達到30％與20％，親水性較好，且細胞親和性較高，優(yōu)于價格昂貴的多聚賴氨酸。為了使以殼聚糖為材料的導(dǎo)管在降解

4、和細胞親和性兩方面都滿足要求，最終篩選出分子量為1000kD，脫乙酰度為95％的殼聚糖作為導(dǎo)管外層 ⑵殼聚糖神經(jīng)導(dǎo)管的設(shè)計制作及其特性研究。設(shè)計了殼聚糖雙層多通道，單通道導(dǎo)管的模具，選用篩選所得的殼聚糖制成具有多通道的神經(jīng)導(dǎo)管，通道直徑為0．1mm，45個通道相互平行，縱向均勻排列于神經(jīng)導(dǎo)管中，導(dǎo)管通道之間由各向異性的梯狀微孔構(gòu)成，微孔之間相互貫穿，孔徑在5～50μm之間。體內(nèi)降解時間可達6到8周，可以滿足外周神經(jīng)修復(fù)的時間要求

5、，多通道導(dǎo)管力學(xué)性能優(yōu)于單通道導(dǎo)管，溶脹系數(shù)變化不大，均滿足體內(nèi)移植和手術(shù)要求。 ⑶殼聚糖神經(jīng)導(dǎo)管及其復(fù)合骨髓間充質(zhì)干細胞修復(fù)大鼠周圍神經(jīng)損傷的研究。對比研究了空白對照組，殼聚糖單通道組，殼聚糖多通道組，殼聚糖多通道復(fù)合骨髓間充質(zhì)干細胞（以Hoechst33258進行核標記）組與自體移植組的神經(jīng)損傷修復(fù)效果，按照坐骨神經(jīng)功能指數(shù)和大體觀察結(jié)果對修復(fù)效果的優(yōu)到劣排序是：自體移植組、多通道復(fù)合干細胞組、多通道組、單通道組、空白對照組

6、；HE染色和甲苯胺藍染色結(jié)果可以看出，各組殼聚糖導(dǎo)管均有良好的組織相容性，再生神經(jīng)的神經(jīng)纖維密度由高到低依次是：多通道復(fù)合干細胞組、多通道組、自體移植組、單通道組、空白對照組；再生神經(jīng)的神經(jīng)纖維直徑由高到低依次是：自體移植組、多通道復(fù)合干細胞組、多通道組、單通道組、空白對照組；nestin免疫組化分析結(jié)果顯示：6周后各組nestin均有表達，表達量由高到低依次是：空白對照組、單通道組、多通道組、多通道復(fù)合骨髓間充質(zhì)干細胞組、自體移植組；

7、熒光示蹤和免疫熒光檢測發(fā)現(xiàn)，與導(dǎo)管復(fù)合移植的骨髓間充質(zhì)干細胞有nestin表達，表明它們已經(jīng)向神經(jīng)干細胞的方向發(fā)生了分化。 ⑷本研究取得的主要研究成果有：①發(fā)現(xiàn)了殼聚糖的分子量和脫乙酰度對殼聚糖體內(nèi)降解性和細胞親和性影響的規(guī)律，為指導(dǎo)選擇合適的殼聚糖制備組織工程支架或?qū)Ч芴峁┝艘罁?jù)，篩選出兩種不同的殼聚糖材料復(fù)合應(yīng)用制備導(dǎo)管。②制備了殼聚糖單通道和多通道導(dǎo)管，發(fā)現(xiàn)后者具有較好的超微結(jié)構(gòu)以及力學(xué)性能，可進一步應(yīng)用于神經(jīng)損傷修復(fù)。③