糖尿病對(duì)大鼠牙周組織、白細(xì)胞介素-6表達(dá)及血清超敏C反應(yīng)蛋白水平的影響.pdf

1、糖尿病是一種系統(tǒng)性疾病，由于糖類，脂肪代謝不良導(dǎo)致高血糖和高血脂；牙周組織疾病是發(fā)生在牙周支持組織（牙齦、牙周膜、牙槽骨）的一種破壞性疾病，最終會(huì)導(dǎo)致牙齒缺失。盡管存在一些爭議，關(guān)于糖尿病和牙周組織疾病的一些相關(guān)關(guān)系已經(jīng)被很多學(xué)者報(bào)道，因此將牙周組織疾病列為糖尿病的第六大并發(fā)癥，糖尿病和牙周組織疾病之間的雙向關(guān)系也成為眾多學(xué)者關(guān)注的熱點(diǎn)。臨床觀察證明，糖尿病患者牙周疾病患病率增高，嚴(yán)重性增加，并且其菌斑指數(shù)、牙齦指數(shù)、牙周袋深度、牙周附

2、著喪失及牙槽骨吸收程度均高于健康人，可能是牙周疾病發(fā)展過程中的一個(gè)重要的危險(xiǎn)因素；動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，在引入外界刺激因素的情況下，如絲線結(jié)扎，菌斑接種等，牙周組織骨喪失在糖尿病大鼠中明顯加重，而無外界刺激因素時(shí)糖尿病對(duì)大鼠牙周組織的影響尚未見明確詳細(xì)報(bào)道。本論文主要研究在沒有外界刺激因素的情況下，糖尿病對(duì)SD大鼠牙周組織及對(duì)炎癥因子如白細(xì)胞介素-6和超敏C反應(yīng)蛋白的影響。 目的： （1）建立2型糖尿病SD大鼠模型； （2

3、）比較不同時(shí)間點(diǎn)，正常對(duì)照組大鼠和糖尿病模型組大鼠牙周組織情況； （3）比較不同時(shí)間點(diǎn)正常組SD大鼠和模型組大鼠頜骨和股骨骨組織X線結(jié)構(gòu)； （4）比較不同時(shí)間點(diǎn)光鏡下正常組SD大鼠和模型組大鼠骨組織結(jié)構(gòu)； （5）比較正常組和模型組大鼠骨組織IL-6免疫組織化學(xué)結(jié)果； （6）比較正常組和模型組大鼠血清超敏C反應(yīng)蛋白水平。 方法： 1．SD大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組和STZ致糖尿病模型組，對(duì)照組8

4、只，模型組30只。模型組大鼠高熱量飼料喂養(yǎng)1個(gè)月后，造成肥胖模型，然后一次性靜脈注射鏈脲佐菌素（Streptozotocin，STZ）（55mg/kg體重），以造成糖尿病模型；正常對(duì)照組大鼠使用普通飼料喂養(yǎng)1個(gè)月后，一次性靜脈注射0．1mol/L，pH4．5相同劑量的檸檬酸緩沖液：監(jiān)測尿糖血糖改變情況，尿糖+++，血糖值≥11．2mmol/L，該指標(biāo)至少持續(xù)2周的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物作為成功的糖尿病大鼠模型。 分別于實(shí)驗(yàn)開始第6，10，12

5、，16周后，隨機(jī)選取大鼠稱取體重，每次對(duì)照組取2只，實(shí)驗(yàn)組7只，3%戊巴比妥鈉麻醉，每只大鼠采血5-7ml，3000r/min離心15分鐘，取血清，分裝保存于-70℃超低溫冰箱。取上下頜骨及雙側(cè)股骨，一側(cè)股骨置于4%福爾馬林液固定備用，另一側(cè)置于-70℃低溫冰箱保存。 2．牙周附著情況：大鼠麻醉后，觀察牙齦色、形、質(zhì)改變及牙齦退縮情況，牙周探針探查大鼠牙周情況。 3．骨組織X線觀察：去除頜骨及股骨上的神經(jīng)肌肉，暴露完整的

6、骨組織，在數(shù)字化牙片X光機(jī)上拍攝骨組織的X線片，工作條件：電壓63Kv，電流8mA，曝光時(shí)間0．080s。 4．骨組織形態(tài)學(xué)觀察：經(jīng)4%福爾馬林液固定24小時(shí)后，取一半頜骨及一側(cè)股骨，口腔科慢速渦輪機(jī)沿股骨長軸及頜骨近遠(yuǎn)中方向制備成5mm厚的骨塊，將骨塊進(jìn)行石蠟包埋，股骨標(biāo)本沿長軸制備5-7um切片，頜骨標(biāo)本制作為近遠(yuǎn)中方向?yàn)?-7um的切片，HE染色。 5．大鼠骨組織IL-6免疫組織化學(xué)：糖尿病大鼠骨組織石蠟切片按常規(guī)

7、脫蠟復(fù)水，雙氧水滅活內(nèi)源性過氧化物酶，枸櫞酸鹽緩沖液進(jìn)行熱抗原修復(fù)，5%牛血清白蛋白封閉后，將IL-6按1：20，1：40，1：80，1：100比例稀釋，37℃恒溫箱孵育一小時(shí)左右；加生物素化山羊抗鼠IgG，放于37℃恒溫箱孵育20分鐘；加SABC，37℃恒溫箱孵育20分鐘；DAB顯色5-30分鐘，光鏡下觀察。 6．大鼠血清超敏C反應(yīng)蛋白的測定：采用免疫散射比濁法，按照說明書編輯參數(shù)，測定結(jié)果。正常值為0～1mg/L。

8、結(jié)果： 1．從血糖測定結(jié)果及尿糖監(jiān)測結(jié)果看，SD大鼠靜脈一次性注射鏈脲佐菌素可成功的建立二型糖尿病大鼠模型，在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中模型組除2只SD大鼠外，其它動(dòng)物在給藥后血糖尿糖均有明顯改變，模型組動(dòng)物在注射鏈脲佐菌素后一周尿糖增高為+++，血糖均高于11．2mmol/L。 2．牙周組織探查結(jié)果：整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中，正常對(duì)照組和模型組大鼠牙齦形狀、質(zhì)地沒有出現(xiàn)明顯異常，未發(fā)現(xiàn)牙齦萎縮，牙周探查深度均維持在初始水平，模型組大鼠后期牙

9、齦顏色輕微發(fā)紅，牙齦出血指數(shù)較對(duì)照組稍稍偏高。 3．骨組織X線檢查結(jié)果：正常對(duì)照組大鼠整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程牙槽嵴高度無明顯改變，實(shí)驗(yàn)開始至第10周時(shí)，對(duì)照組和模型組大鼠牙槽骨在X線片上未見明顯異常，牙槽嵴頂白線清晰可見，股骨骨皮質(zhì)稍顯增厚；第12周模型組大鼠牙槽骨及股骨出現(xiàn)骨密度減低區(qū)伴有骨小梁的吸收，X線片呈現(xiàn)透射影像。 4．骨形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果：在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中，對(duì)照組大鼠的股骨與頜骨骨皮質(zhì)、骨小梁結(jié)構(gòu)清楚，在鏡下可看到骨小梁走

10、行向各個(gè)方向，形態(tài)不一，交織成網(wǎng)；糖尿病大鼠牙槽嵴高度無明顯改變，自第12周可觀察到股骨及頜骨骨吸收活躍，骨皮質(zhì)變薄，骨小梁變細(xì)，HE染色破骨細(xì)胞及骨吸收陷窩明顯可見。 測量骨皮質(zhì)厚度和骨小梁數(shù)目，以健康對(duì)照組大鼠作為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行比較，除第10周外，各組之間均有差異（F=60．729，P=0．000），糖尿病模型組大鼠骨皮質(zhì)厚度第6周與正常組差異性顯著，P值為0．015，開始變??；第10周糖尿病模型組大鼠骨皮質(zhì)厚度與正常對(duì)照組統(tǒng)計(jì)學(xué)

11、上無差異（P>0．05），可能是由于骨外膜反應(yīng)性增厚引起的；第12，16周模型組骨皮質(zhì)厚度與正常組差異性顯著（P均為0．000，P<0．05），與正常對(duì)照組相比骨皮質(zhì)變??；糖尿病組大鼠骨小梁數(shù)目在五組之間有差異（F=11．270，P=0．000），第6，12，16周骨皮質(zhì)厚度與正常對(duì)照組相比均有差異（P<0．05），骨小梁數(shù)目減少；第6周糖尿病組大鼠骨小梁數(shù)目與正常組統(tǒng)計(jì)學(xué)上無差異（P=0．135，P>0．05）；第10，12，16周骨

12、小梁數(shù)目與正常組差異性顯著（P分別為0．041，0．001，0．000，P<0．05），骨小梁數(shù)目減少。 5．骨組織IL-6免疫組織化學(xué)反應(yīng)結(jié)果：正常大鼠的骨組織IL-6免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示：淡黃色染色彌散顆粒包繞骨小梁和骨髓腔；糖尿病組大鼠整個(gè)髓腔內(nèi)，可見黃色染色彌散顆粒包繞骨小梁，與正常組骨組織相比沒有明顯差異，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析無差異。 6．大鼠血清超敏C反應(yīng)蛋白的測定結(jié)果：糖尿病模型組超敏C反應(yīng)蛋白與正常對(duì)照組比較統(tǒng)計(jì)學(xué)

13、意義顯著，P值為0．000（P<0．01），高于正常對(duì)照組，糖尿病模型組大鼠血糖，甘油三酯和正常對(duì)照組大鼠相比差異性顯著，P值分別為0．000，0．002（P<0．01），而總膽固醇兩組數(shù)值無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P值為0．401（P>0．05），變化不明顯。 結(jié)論： 1．SD大鼠靜脈一次性注射鏈脲佐菌素可成功的建立二型糖尿病大鼠模型，在給藥后血糖尿糖均有明顯改變，模型組動(dòng)物在注射鏈脲佐菌素后一周尿糖增高為+++，血糖均高于11．

14、2mmol/L。 2．模型組大鼠和正常對(duì)照組在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中，牙周組織改變不明顯，可以認(rèn)為在沒有外界刺激因素的情況下，糖尿病并不能作為一個(gè)單獨(dú)的病因引起牙周病。 3．糖尿病模型組和正常對(duì)照組大鼠骨組織IL-6免疫組織化學(xué)反應(yīng)差別不大，提示骨組織中IL-6的表達(dá)是很少量的。 4．糖尿病模型組大鼠血清中超敏C反應(yīng)蛋白水平顯著高于正常對(duì)照組，急性時(shí)相炎癥因子出現(xiàn)，說明機(jī)體處于炎癥狀態(tài)，對(duì)于牙周組織疾病的發(fā)生是一個(gè)危險(xiǎn)信