藥用野生稻中淀粉合成酶基因家族的進(jìn)化.pdf

1、世界上近一半人口都以稻米為食，而稻米中最主要的成分就是淀粉，各國的科學(xué)家從基礎(chǔ)研究和應(yīng)用等領(lǐng)域?qū)λ镜矸鄣暮铣蛇^程和個(gè)體基因功能進(jìn)行了大量的探索研究，為水稻優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)、高抗做出了重要貢獻(xiàn)。對于控制淀粉合成的淀粉合成酶基因一直是科學(xué)研究關(guān)注的焦點(diǎn)，其重要性不言而喻。藥用野生稻(Oryzaofficinalis Wall.ex Watt)隸屬于禾本科(Poaceae)，是世界上最重要的糧食作物—水稻(O. sativa L.)的親緣種，也是

2、其遺傳改良的重要基因源。將藥用野生稻做為實(shí)驗(yàn)對象進(jìn)行深入研究，不但可以把握淀粉合成酶基因在同屬內(nèi)的自然進(jìn)化規(guī)律，而且可以為水稻的遺傳育種和品質(zhì)改良提供必要的分子數(shù)據(jù)。鑒于此，本研究利用水稻基因組數(shù)據(jù)，在全面挖掘栽培稻淀粉合成酶基因家族整體進(jìn)化細(xì)節(jié)的基礎(chǔ)上，選取藥用野生稻作為植物材料，通過轉(zhuǎn)錄組測序、基因體外擴(kuò)增和測序以及qRT-PCR基因表達(dá)定量等實(shí)驗(yàn)手段，全面總結(jié)了藥用野生稻內(nèi)淀粉合成酶基因家族的基因構(gòu)成、序列特點(diǎn)以及表達(dá)分化等進(jìn)化特

3、點(diǎn)并探討了它們和栽培稻同源基因之間的具體差異。具體研究結(jié)果如下：
　　一、利用第二代測序技術(shù)，對藥用野生稻(O.officinalis)葉轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行了調(diào)查。結(jié)果獲得大約2.3×107個(gè)高質(zhì)量的讀條，每個(gè)讀條長100bp，總計(jì)約2.1×109個(gè)堿基長。采用De Novo方式重頭組裝出非冗余的單基因68132條，總長度約83Mbp。通過和NCBI、SWISS、KEGG、COG、GO和InterPro等數(shù)據(jù)庫內(nèi)數(shù)據(jù)的相似性比較，這些單基

4、因的功能被進(jìn)一步注釋。
　　二、通過對栽培稻(O. sativa)全基因組的全面分析，發(fā)現(xiàn)水稻的淀粉合成酶基因家族共包括11個(gè)成員(SSI、SSII-1、SSII-2、SSII-3、SSIII-1、SSIII-2、SSIV-1、SSIV-2、SSV、GBSSI和GBSSII)，分別定位在1、2、4-8和10號等8個(gè)染色體上，基因結(jié)構(gòu)各異，各包括8-20個(gè)外顯子，mRNA編碼長度在1827 bp-4662 bp之間變動。
　　

5、藥用野生稻的葉轉(zhuǎn)錄組中共有18728個(gè)讀條能夠順利匹配到11個(gè)栽培稻淀粉合成酶基因上，經(jīng)拼接，我們獲得了8個(gè)淀粉合成酶基因(SSI、SSII-1、SSII-2、SSIII-1、SSIII-2、SSIV-2、SSV和GBSSII)的完整編碼序列，這8個(gè)基因和它們栽培稻同源基因之間，在氨基酸序列水平的相似性均可以達(dá)到93％以上。此外，基于Ka/Ks的統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)證明這8個(gè)基因在野生和栽培狀態(tài)均處于嚴(yán)格的純化之下。此外，有3個(gè)在栽培稻中出現(xiàn)的淀粉

6、合成酶基因(SSII-3、SSIV-1和GBSSI)由于在藥用野生稻葉轉(zhuǎn)錄組中出現(xiàn)的讀條過少而未能成功拼接成完整基因，初步分析可能和這些基因在葉中表達(dá)水平偏低有關(guān)。
　　三、根據(jù)已知的栽培稻、擬南芥、玉米和我們得到的藥用野生稻序列，我們構(gòu)建了最大似然性系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果發(fā)現(xiàn)4個(gè)物種的淀粉合成酶基因完全按照基因功能進(jìn)行聚類，藥用野生稻的8個(gè)基因全部置于不同功能分支內(nèi)，顯示了我們基于轉(zhuǎn)錄組識別的淀粉合成酶基因的正確性。
　　四、為

7、了驗(yàn)證藥用野生稻中淀粉合成酶各基因是否存在不同的表達(dá)，我們根據(jù)藥用野生稻8個(gè)完整基因(SSI、SSII-1、SSII-2、SSIII-1、SSIII-2、SSIV-2、SSV和 GBSSII)以及水稻3個(gè)淀粉合成酶基因(SSII-3、SSIV-1和GBSSI)的保守區(qū)設(shè)計(jì)mRNA引物，并分別在藥用野生稻的葉和種子兩個(gè)不同器官內(nèi)對這11個(gè)基因?qū)嵤┝艘幌盗衠RT-PCR實(shí)時(shí)定量操作。結(jié)果表明，淀粉合成酶基因家族不同成員的表達(dá)差異不但在相同器