低密度脂蛋白受體基因點(diǎn)突變?nèi)旧w原位修復(fù)及調(diào)控表達(dá)的研究.pdf

1、目的： 家族性高膽固醇血癥(familial cholesterolemia，F(xiàn)H)的致病基因是位于19號(hào)染色體上的低密度脂蛋白受體(LDLR)基因，大多為點(diǎn)突變，是最常見(jiàn)的單基因遺傳病之一，屬公認(rèn)的遺傳性疾病基因治療的首選病種。已進(jìn)行的研究表明現(xiàn)行的基因治療方法在安全性和持久性方面尚有不少問(wèn)題。新近報(bào)道的對(duì)點(diǎn)突變進(jìn)行染色體(靶向)原位修復(fù)是一種全新的理念，有望獲得重大突破。修飾的單鏈DNA寡核苷酸(modified singl

2、e-stranded DNA oligonucleotide，MSO)被證實(shí)可以較低頻率地修復(fù)報(bào)告基因中的點(diǎn)突變。本研究的目的是建立LDLR基因點(diǎn)突變的細(xì)胞模型，進(jìn)行MSO靶向基因原位修復(fù)試驗(yàn)，為探索FH的基因治療打基礎(chǔ)，由此建立的策略方法也適用于其他以點(diǎn)突變?yōu)橹鞯膯位蜻z傳性疾病，具有較高理論價(jià)值和應(yīng)用前景。同時(shí)本研究還建立了LDLR基因四環(huán)素調(diào)控穩(wěn)定細(xì)胞系，為研究LDLR基因功能和FH的基因治療提供了新的細(xì)胞模型。 方法：

3、 低密度脂蛋白受體基因點(diǎn)突變細(xì)胞模型構(gòu)建為了構(gòu)建質(zhì)粒表達(dá)載體plRES-Hyg-WT-LDLR-EGFP、pIRES-Hyg-556-LDLR-EGFP和pIRES-Hyg-660-LDLR-EGFP，人低密度脂蛋白受體基因的cDNA編碼序列被插入到質(zhì)粒表達(dá)載體pIRES-Hyg的多克隆位點(diǎn)。WT即野生型LDLR基因，556是LDLR基因在12外顯子1730位有G→C點(diǎn)突變，660是LDLR基因在14外顯子2043位有C→A點(diǎn)突變

4、。三種質(zhì)粒表達(dá)載體分別制備，純化后的質(zhì)粒DNA通過(guò)脂質(zhì)體介導(dǎo)分別轉(zhuǎn)染CHO、HepG2和Vero細(xì)胞， 600μg/mlHygromycin篩選抗性細(xì)胞克隆，通過(guò)(1)熒光顯微鏡觀察EGFP的表達(dá)；(2)提取陽(yáng)性克隆細(xì)胞的基因組作為模板，PCR鑒定SNP位點(diǎn)；(3)western blot檢測(cè)LDLR-EGFP融合蛋白的表達(dá)； (4)檢測(cè)LDLR受體對(duì)Dil標(biāo)記的人低密度脂蛋白(DiI-LDL)的攝取功能；對(duì)構(gòu)建的穩(wěn)定細(xì)胞模型進(jìn)行鑒定。

5、 低密度脂蛋白受體基因點(diǎn)突變?cè)恍迯?fù)對(duì)構(gòu)建的穩(wěn)定細(xì)胞模型Vero-660的LDLR基因點(diǎn)突變進(jìn)行原位修復(fù)，以突變點(diǎn)為中心，分別合成15 nt、25 nt、31nt、35 nt和45 nt長(zhǎng)度，末端6個(gè)堿基硫代修飾的MSO，每個(gè)長(zhǎng)度的鏈合成4條，分別為兩條修復(fù)鏈：與編碼鏈一致為反義鏈；與模板鏈一致為正義鏈；兩條對(duì)照鏈：C鏈與編碼鏈一致，但未糾正突變位點(diǎn)；NC鏈為無(wú)關(guān)對(duì)照鏈。利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染細(xì)胞系，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞EGFP的表達(dá)，初

6、步確定修復(fù)效率。通過(guò)流式細(xì)胞儀分選EGFP+細(xì)胞，利用Dil-LDL內(nèi)移實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證LDLR的功能，培養(yǎng)一定時(shí)間后，提取核酸和蛋白質(zhì)分別進(jìn)行焦磷酸測(cè)序分析和Western Blot檢測(cè)，確定最終的修復(fù)效率. 低密度脂蛋白受體基因調(diào)控表達(dá)首先構(gòu)建質(zhì)粒表達(dá)載體pIRES-TetR-Hyg，即以pcDNA6/TR質(zhì)粒核酸為模板，設(shè)計(jì)引物，PCR擴(kuò)增TetR片段，插入到質(zhì)粒表達(dá)載體pIRES-Hyg的多克隆位點(diǎn)。同時(shí)構(gòu)建質(zhì)粒表達(dá)載體pCDN

7、A4/TO-WT-LDLR-EGFP，即人低密度脂蛋白受體基因的cDNA編碼序列插入質(zhì)粒表達(dá)載體pCDNA4/TO的多克隆位點(diǎn)，WT即野生型LDLR基因。將構(gòu)建好的兩種質(zhì)粒表達(dá)載體pIRES-TetR-Hyg和pCDNA4/TO-WT-LDLR-EGFP通過(guò)脂質(zhì)體介導(dǎo)分別共轉(zhuǎn)染CHO和HepG2細(xì)胞，周600 μg/ml Hygromycin和400 μg/ml Zeocin篩選抗性細(xì)胞克隆。以2μg/ml 四環(huán)素誘導(dǎo)LDLR基因表達(dá)，

8、通過(guò)(1)熒光顯微鏡觀察EGFP的表達(dá)；(2)western blot檢測(cè)LDLR-EGFP蛋白的表達(dá)； (3)檢測(cè)LDLR受體對(duì)DiI-LDL的攝取功能；對(duì)構(gòu)建的低密度脂蛋白受體基因調(diào)控細(xì)胞模型進(jìn)行鑒定。 結(jié)果： 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示野生型和點(diǎn)突變LDLR基因的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞模型構(gòu)建成功，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pIRES-Hyg-WT-LDLR-EGFP質(zhì)粒的細(xì)胞系，分別命名為HepG2-WT、CHO-WT和Vero-WT；穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pIRES

9、-Hyg-556-LDLR-EGFP質(zhì)粒的細(xì)胞系，分別命名為HepG2-556、CHO-556和Vero-556；穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pIRES-Hyg-660-LDLR-EGFP質(zhì)粒的細(xì)胞系，分別命名為HepG2-660、CHO-660和Vero-660。其中HepG2-WT、CHO-WT和Vero-WT細(xì)胞系中有正常野生型LDLR基因，而LDLR受體是膜受體，因此熒光顯微鏡下可觀察到熒光主要分布在細(xì)胞膜上，將Dil標(biāo)記的人低密度脂蛋白與細(xì)胞相互

10、作用后，激光共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果顯示，外源性的低密度脂蛋白受體具有正常的與配基相結(jié)合的功能。同時(shí)Western blot結(jié)果進(jìn)一步提示，細(xì)胞中有大量的外源性低密度脂蛋白受體蛋白的表達(dá)。HepG2-556、CHO-556和Vero-556細(xì)胞系中的LDLR基因在12外顯子1730位有G→C點(diǎn)突變，由于該突變，導(dǎo)致LDLR受體雖然能表達(dá)但不能定位于細(xì)胞膜，因此熒光顯微鏡下可觀察到熒光主要分布在細(xì)胞質(zhì)中.HepG2.660、CHO一660和V

11、ero-660細(xì)胞系中的LDLR基因在14外顯子2043位有C→A點(diǎn)突變，該突變導(dǎo)致提前出現(xiàn)終止密碼子，使LDLR受體及下游的EGFP蛋白均無(wú)法表達(dá)，因此熒光顯微鏡觀察無(wú)熒光可見(jiàn)。 對(duì)構(gòu)建的穩(wěn)定細(xì)胞模型Vero-660的LDLR基因點(diǎn)突變進(jìn)行原位修復(fù)，由于Vero-660的LDLR基因點(diǎn)突變屬于無(wú)義突變，能較簡(jiǎn)便判別修復(fù)效率，不能修復(fù)者，突變位點(diǎn)下游部分均不能表達(dá).凡能糾正該點(diǎn)突變者即可獲得包括EGFP的完整表達(dá)產(chǎn)物，修復(fù)效率越

12、高，EGFP的表達(dá)越多.本研究以此為模型，通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)EGFP的表達(dá)，分析比較不同MSO的修復(fù)效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)35 A-MSO具有較好的效果，EGFP陽(yáng)性比例為4.99±0.74％。但通過(guò)Pyrosequencing測(cè)序，結(jié)果顯示熒光轉(zhuǎn)陽(yáng)細(xì)胞克隆的突變修復(fù)率為10.72±0.93％，因此確切的突變修復(fù)率應(yīng)為0.53％左右。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果還顯示我們成功構(gòu)建了LDLR.基因四環(huán)素調(diào)控表達(dá)細(xì)胞模型，HepG2和CHO四環(huán)素調(diào)控細(xì)胞分別

13、命名為HepG2-TetR-WT，CHO-TetR-WT。調(diào)控細(xì)胞加入四環(huán)素前，熒光顯微鏡觀察無(wú)綠色熒光可見(jiàn)，加入四環(huán)素后，熒光顯微鏡可見(jiàn)細(xì)胞內(nèi)有大量綠色熒光，且熒光主要分布在細(xì)胞膜上，將Dil-LDL與細(xì)胞相互作用后，激光共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果顯示，外源性的低密度脂蛋白受體具有正常的與配基相結(jié)合的功能。同時(shí)Western blot結(jié)果進(jìn)一步提示，細(xì)胞中有大量的外源性低密度脂蛋白受體蛋白的表達(dá)，表明構(gòu)建的細(xì)胞模型LDLR基因受四環(huán)素調(diào)控且