膀胱癌抑癌基因Apaf-1和APC基因啟動子甲基化的臨床與基礎研究.pdf

1、膀胱癌是我國泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤。世界范圍內(nèi)，膀胱癌發(fā)病率居惡性腫瘤的第九位，在男性排名第六位，女性排在第十位之后，其中超過90％的膀胱癌為尿路上皮癌(UC)，具有易復發(fā)和進展的特點。膀胱癌發(fā)病的具體分子機制目前尚不明確，與其他惡性腫瘤一樣，膀胱癌的發(fā)生是多基因、多階段變異累積形成的病理過程，也是一個涉及多基因、多信號通路參與的復雜過程。目前膀胱癌發(fā)病、復發(fā)和進展的分子機制仍然是泌尿外科的研究熱點。表觀遺傳學機制在腫瘤中具有重要作用

2、，其中抑癌基因啟動子甲基化可引起染色體結構和穩(wěn)定性的改變，導致基因表達失活，參與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。研究發(fā)現(xiàn)抑癌基因的異常甲基化不是隨機出現(xiàn)的，其具有基因特異性和腫瘤特異性，已在膀胱癌、前列腺癌、肺癌等惡性腫瘤患者的組織和血液、尿液等體液中發(fā)現(xiàn)多種抑癌基因的異常甲基化，同時其甲基化同腫瘤的分期和分化及預后相關，并可能成為腫瘤特異性的分子標記物。另外基因啟動子甲基化改變不涉及DNA序列的改變，是可逆的，可被DNA甲基轉移酶抑制劑逆轉，恢復抑

3、癌基因的表達，通過誘導腫瘤細胞周期阻滯和凋亡抑制細胞的增值，可能成為腫瘤治療的新途徑。因此，研究膀胱癌中抑癌基因的甲基化對理解膀胱癌的發(fā)病機制、建立新的腫瘤標記物以及預后分析和治療均具有重要意義。
　　 組蛋白乙?；揎椧彩潜碛^遺傳調(diào)控主要的研究內(nèi)容之一，其通過改變?nèi)旧|的構型調(diào)控基因轉錄，組蛋白乙酰化促進基因轉錄，去乙酰化抑制基因轉錄。目前研究發(fā)現(xiàn)DNA甲基化同組蛋白乙?；哂忻芮嘘P系，組蛋白去乙?；荄NA甲基化抑制基因轉錄

4、的重要下游機制之一。組蛋白去乙酰化酶抑制劑TSA可增強表觀抑制的抑癌基因的表達，抑制細胞增殖，在腫瘤的表觀遺傳學治療中具有重要意義。
　　 凋亡蛋白酶活化因子-1基因(Apoptosis protease activating factor-1，Apaf-1)和腺瘤性結腸息肉病基因(adenomatous polyposis coli，APC)是兩種重要的抑癌基因，分別在線粒體凋亡途徑和Wnt信號傳導通路調(diào)控中發(fā)揮著重要作用，而

5、膀胱癌中Apaf-1、APC基因表觀遺傳學調(diào)控機制的研究報道較少。本研究通過甲基化特異性PCR方法檢測膀胱移行細胞癌組織中Apaf-1和APC的啟動子甲基化狀態(tài)，分析兩種抑癌基因的啟動子甲基化狀態(tài)與膀胱癌臨床特點及復發(fā)的關系，并檢測人膀胱癌T24細胞株中Apaf-1基因啟動子的甲基化狀態(tài)，并應用不同濃度的DNA甲基轉移酶抑制劑5-氮雜-2'-脫氧胞苷(5-Aza-2'-deoxycytidine，5-Aza-CdR)對膀胱癌T24細胞株

6、進行處理，觀察其細胞生物學行為改變和Apaf-1基因的表達情況，鑒于組蛋白乙?；{(diào)節(jié)與啟動子甲基化的重要關系，本研究進一步應用組蛋白去乙?；敢种苿┣乓志谹(trichostatin A，TSA)體外作用于人膀胱癌T24細胞株，觀察其細胞生物學行為改變和Apaf-1、APC表達的變化。本研究為探討膀胱癌發(fā)生、發(fā)展的機制和建立臨床早期診斷和預后的標記物提供實驗依據(jù)，并為膀胱癌的表觀遺傳學治療提供新的靶點。本研究分為三個部分：
　

7、　 第一部分：膀胱癌抑癌基因Apaf-1和APC的甲基化狀況及其臨床意義。
　　 目的：研究抑癌基因細胞凋亡蛋白酶活化因子-1(Apaf-1)和腺瘤性結腸息肉病基因(APC)的啟動子甲基化狀況與膀胱癌臨床病理的關系及對患者復發(fā)的影響。
　　 方法：采用甲基化特異性PCR方法檢測110例膀胱癌組織中Apaf-1和APC的啟動子甲基化狀態(tài)，以15例正常膀胱黏膜組織為對照組。
　　 結果：Apaf-1和APC基因在膀

8、胱癌組織中的甲基化率為90.0％和82.7％，在正常膀胱組織為6.77％和20.0％，差異分別有統(tǒng)計學意義(P均=0.000)。膀胱癌中Apaf-1及APC基因的甲基化率隨腫瘤分級、分期的增加而升高，而不同性別、不同年齡以及腫瘤單發(fā)與多發(fā)之間的比較分別無顯著性差異(P均＞0.05)。有淋巴結轉移的患者Apaf-1啟動子甲基化陽性率明顯高于無淋巴結轉移的患者(P＜0.05)。在復發(fā)組與未復發(fā)組的比較中，Apaf-1的甲基化陽性率分別為97

9、.6％(41/42)和85.3％(58/68)，差異有統(tǒng)計學意義(x2=4.382，P=0.036)，而APC的甲基化率分別為85.7％(36/42)和80.9％(55/68)，差異無統(tǒng)計學意義(x2=0.424，P=0.515)。
　　 結論：Apaf-1及APC基因啟動子甲基化在膀胱癌的發(fā)生、發(fā)展過程中具有重要作用，Apaf-1啟動子甲基化可能成為膀胱癌患者預后判斷的分子標志物。
　　 第二部分：5-氮雜-2，-脫氧

10、胞苷對人膀胱癌T24細胞系增殖及Apaf-1基因表達的影響。
　　 目的：觀察5-氮雜-2'-脫氧胞苷(5-Aza-CdR)對人膀胱癌T24細胞增殖、凋亡的影響及對Apaf-1基因表達的影響。
　　 方法：甲基化特異性PCR(MSP)方法檢測膀胱癌T24細胞株中Apaf-1基因的甲基化狀態(tài)；應用不同濃度的5-Aza-CdR處理人膀胱癌T24細胞，噻唑藍(MTT)比色法檢測細胞生長抑制率；流式細胞術檢測細胞周期和凋亡的變化

11、情況；逆轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)法檢測Apaf-1基因mRNA水平改變；Westernblot法檢測Apaf-1蛋白的表達變化。
　　 結果：T24細胞Apaf-1基因啟動子呈甲基化狀態(tài)；5-Aza-CdR對T24細胞的生長具有明顯的抑制作用，5-Aza-CdR作用后T24細胞出現(xiàn)細胞周期阻滯，細胞凋亡率明顯增加。5-Aza-CdR處理組中Apaf-1基因的mRNA和蛋白表達較對照組明顯增加。
　　 結論：T2

12、4細胞Apaf-1基因啟動子呈甲基化狀態(tài)，5-Aza-CdR可增強Apaf-1基因的表達，通過誘導T24細胞凋亡和周期阻滯抑制T24細胞的生長。
　　 第三部分：曲古抑菌素A對膀胱癌T24細胞增殖及Apaf-1和APC基因表達的影響。
　　 目的：研究組蛋白去乙?；敢种苿┣乓志谹(TSA)對人膀胱癌T24細胞的增殖抑制作用及對Apaf-1、APC基因表達的影響。
　　 方法：采用3×104 mmol/L T

13、SA作用T24細胞，MTT法檢測TSA對T24細胞生長的抑制作用；流式細胞術(FCM)檢測TSA作用前后T24細胞周期和凋亡的變化；逆轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)法檢測TSA作用前后膀胱癌細胞中Apaf-1、APC mRNA表達的變化。
　　 結果：TSA對T24細胞的生長具有明顯的抑制作用；TSA作用后T24細胞的G0/G1期比例增加，S期比例減少，細胞凋亡率增加(P＜0.05)；RT-PCR結果顯示TSA處理能明顯誘導