凝溶膠蛋白在急性放射損傷防護中的作用.pdf

1、大腸癌是常見的消化道腫瘤之一，在我國大腸癌發(fā)病率逐年上升，在上海等大城市已與發(fā)達國家相近。然而，關(guān)于大腸癌的發(fā)病機制尚不完全清楚。目前的研究普遍認為大腸癌的發(fā)生是多因素、多步驟交互作用的結(jié)果，是在一系列基因損傷所致基因突變的誘導(dǎo)效應(yīng)下原癌基因的激活以及抑癌基因失活，繼而引發(fā)細胞的過度增殖和異常的程序性死亡所致。其中涉及多種關(guān)鍵調(diào)節(jié)酶的改變，在細胞形態(tài)發(fā)生明顯變化之前，這種改變已經(jīng)在分子及代謝水平發(fā)生。許多細胞的癌變都與控制細胞增殖及凋亡

2、的信號網(wǎng)絡(luò)中某一環(huán)節(jié)的失調(diào)有關(guān)，最終表現(xiàn)為某個基因及其衍生通道的失調(diào)。最近從一些實驗組中觀察到在腫瘤病人包掛大腸癌病人中L-精氨酸和L-瓜氨酸在循環(huán)中均有下降。體外的研究發(fā)現(xiàn)L-精氨酸(L-Arg)及其主要代謝產(chǎn)物——L-瓜氨酸(L-Cit)對腫瘤的生長都起著重要的作用。然而，在大腸癌組織細胞中L-精氨酸和L-瓜氨酸的水平以及分子調(diào)節(jié)機制卻未有研究報道。因此，明確L-精氨酸和L-瓜氨酸以及分子調(diào)節(jié)機制在大腸癌發(fā)生和發(fā)展中的作用，對揭示大

3、腸癌的發(fā)病原因及進一步指導(dǎo)臨床診斷和治療，具有重要意義。
　　 本課題研究目的：
　　 大腸癌的發(fā)生機制尚不清楚。目前的研究普遍認為腫瘤發(fā)生、浸潤和轉(zhuǎn)移是復(fù)雜而有序的多階段生物學(xué)過程，受到多種酶的調(diào)控。大腸癌的發(fā)生是多因素、多步驟、內(nèi)外因交互作用的結(jié)果，是在一系列酶誘導(dǎo)下原癌基因的激活以及抑癌基因失活，繼而引發(fā)細胞的過度增殖和異常的程序性死亡所致。其外因包括物理、化學(xué)和生物致癌因素，內(nèi)因則涉及很多關(guān)鍵調(diào)節(jié)酶的改變，在細胞

4、形態(tài)發(fā)生明顯變化之前，已經(jīng)在分子及代謝水平發(fā)生了異常的改變，因此明確大腸癌的代謝調(diào)節(jié)改變對進一步預(yù)防大腸癌的發(fā)生及指導(dǎo)臨床治療具有重要意義。
　　 在人體中，L-精氨酸不僅是合成蛋白質(zhì)的一種重要的原料，而且還在生理功能方面有著重要的作用，其在精子的發(fā)生，胚胎的發(fā)育，胎兒的生長，和新生兒的成長，血管緊張度的維持，細胞分裂、血流動力學(xué)以及免疫功能等各個方面都扮演著重要的角色。初步的臨床研究觀察到，在腫瘤病人包括大腸癌病人中L-精氨酸

5、和L-瓜氨酸在循環(huán)中均有下降。但其在大腸癌組織細胞中L-精氨酸和L-瓜氨酸的含量水平卻未有研究報道。體外研究表明，L-精氨酸是腫瘤細胞生存必須的氨基酸，尤其是那些因為精氨酸琥珀酸合成酶表達缺陷的腫瘤細胞，比如胰腺癌、肝癌、前列腺癌依賴于微環(huán)境中的L-精氨酸。本課題試圖集中于L-精氨酸的代謝途徑與大腸癌的發(fā)病機制中的關(guān)系，著手于以下三個方面進行研究：
　　 首先，本課題采用了高效液相色譜法，對大腸癌病人的血清以及腫瘤組織中L-精氨

6、酸以及L-瓜氨酸進行了分析。弄清L-精氨酸在大腸癌組織中的生物利用度。
　　 其次，本課題測定了影響細胞內(nèi)精氨酸合成的精氨酸琥珀酸合成酶在大腸癌細胞表達情況，從而弄清大腸癌腫瘤細胞調(diào)節(jié)精氨酸生物利用度的分子機制。
　　 最后，本課題進一步探討了大腸癌腫瘤組織對精氨酸轉(zhuǎn)運的分子機制，即應(yīng)用定量PCR的方法檢測了調(diào)節(jié)精氨酸轉(zhuǎn)運的相關(guān)基因的表達。
　　 通過以上的深入研究，本課題從臨床基礎(chǔ)的角度探討大腸癌組織中精氨酸代

7、謝途徑的變化及其可能的大腸癌發(fā)生發(fā)展新的分子機理。這一新的研究方向，將有利于發(fā)現(xiàn)和開發(fā)新的大腸癌診斷方法和分子靶向治療的新靶點，最終進一步改善大腸癌的綜合診療效果。
　　 本課題研究方法：
　　 1.研究對象：
　　 取22位大腸癌病人。男12名，女10名，平均59±13歲，(年齡范圍于37至79歲)。所采集病例為2009年5月至2009年8月上海長征醫(yī)院普通外科本研究組收治的大腸癌病人。其中包括5例乙狀結(jié)腸癌、

8、4例降結(jié)腸癌、6例直腸癌、5例升結(jié)腸癌、2例橫結(jié)腸癌。
　　 取共25例健康志愿者，男16例、女9例，平均年齡56±10歲，年齡39至74歲。性別與年齡與病例組對比，統(tǒng)計學(xué)上無顯著差別。
　　 2.方法：空腹靜脈取血，收集血清樣品。血樣品處于4000×g離心10分鐘，血清置于-80℃直至用于分析。組織全部取材于大腸癌病人。手術(shù)中，切除腫瘤標(biāo)本的腫瘤部分和正常部分同時采取，組織置于-80℃直至用于分析。
　　 第一

9、部分：L-精氨酸以及L-瓜氨酸的測定
　　 取200μl血清與80μL三氯乙酸(0.1 g/mL)混合，置于75-80℃下15分鐘，之后以10,000×g離心15分鐘，上層清液置于另一試管中并且與100μL異硫氰酸苯酯(含甲醇、乙醇、三乙胺、超純水)衍生化反應(yīng)物，置于室溫下反應(yīng)20分鐘，衍生化之后，將混合物冷凍干燥加入流動相A，再將分解液濾過，取20μl進行高效液相色譜法(HPLC)分析。腫瘤組織和腫瘤的正常組織部分被精確稱量，

10、并且每0.1的組織都在冰浴條件下經(jīng)過與三氯乙酸充分溶解。組織勻漿溶解液離心后取上清，接下來的操作同血清樣本。
　　 腫瘤組織和血清中的L-精氨酸以及L-瓜氨酸的含量由反相高效液相色譜法經(jīng)紫外線測定。分析物的成分及含量從標(biāo)準(zhǔn)樣本所繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線中進行回歸分析計算。血清和組織中的L-精氨酸以及L-瓜氨酸含量分別以μmol/L和μg/g表達。應(yīng)用SPSS14.0統(tǒng)計軟件。組間比較采用Student's t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)

11、計學(xué)意義。
　　 第二部分：精氨酸琥珀酸合成酶在大腸癌組織表達的測定
　　 取組織制成4μm的石蠟切片，然后經(jīng)脫蠟、水洗、抗原修復(fù)、羊血清封閉后滴加抗人精氨酸琥珀酸合成酶的第一抗體1小時/4攝氏度冰箱過夜。再用PBS沖洗后，滴加相應(yīng)的酶標(biāo)二抗EvisvisionTM在37攝氏度培育40分鐘，進而DAB顯色3-10分鐘或顯微鏡下觀察染色效果。
　　 所取腫瘤病人的腫瘤組織以及正常組織殘端進行免疫組化以及蛋白印記檢測

12、來比較精氨酸琥珀酸合成酶在病理和生理狀態(tài)下的表達情況。
　　 第三部分：定量PCR檢測精氨酸轉(zhuǎn)運相關(guān)基因的表達
　　 取約100mg組織放于玻璃研磨器內(nèi)，先加0.2ml的Trizol溶液，研磨組織后，再加氯仿并離心。上層水相進一步加入異丙醇沉淀并洗脫RNA。提取的RNA保存于-70℃超低溫冰箱中，或立即用于逆轉(zhuǎn)錄。
　　 提取的RNA用SSIII逆轉(zhuǎn)錄酶/AMV逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后立即應(yīng)用Thermal

13、 Cycler DiceTM Real Time System擴增儀進行的PCR擴增。PCR反應(yīng)應(yīng)用SYBR(R) Premix Ex TaqTM。內(nèi)參為GPDH。比較腫瘤組織與正常大腸組織測定結(jié)果。本課題測定了與精氨酸轉(zhuǎn)運相關(guān)的CAT-1，CAT-2等八個基因在腫瘤組織中與正常組織中的表達情況。
　　 本課題主要結(jié)果：
　　 一、對大腸癌患者和正常人血清中的L-精氨酸和L-瓜氨酸的濃度測定結(jié)果表明，大腸癌病人中兩者的血

14、清濃度均要低于正常人。與對照組比，22位大腸癌病人的血清L-精氨酸和L-瓜氨酸濃度均明顯減少(分別是P＜0.01和P＜0.001)。L-瓜氨酸在血清中的濃度下降要比L-精氨酸下降的多，造成了在病人血清中L-瓜氨酸/L-精氨酸的比率低于正常對照組P＜0.05。
　　 測量腫瘤組織中的L-精氨酸和L-瓜氨酸的含量，發(fā)現(xiàn)同一個病人中，L-精氨酸和L-瓜氨酸在大腸癌腫瘤組織的濃度水平要高于其在正常殘端的兩倍。在22位大腸癌病人組織中，這

15、個結(jié)果具有重復(fù)性。同一病人中，大腸癌灶組織中L-精氨酸和L-瓜氨酸的濃度要顯著高于正常組織中的L-精氨酸和L-瓜氨酸的濃度(P＜0.005和P＜0.01同等)。然而，大腸癌與正常組織中L-瓜氨酸/L-精氨酸比率沒有顯著差異，表明大腸癌細胞和正常大腸上皮細胞對L-瓜氨酸/L-精氨酸的代謝途徑是相同的。
　　 二、通過免疫組化以及蛋白印記，發(fā)現(xiàn)：大腸癌組織中調(diào)節(jié)L-精氨酸和L-瓜氨酸含量的精氨酸琥珀酸酶的表達明顯高于其在正常組織的表

16、達。
　　 三、通過應(yīng)用螢光定量PCR測定精氨酸轉(zhuǎn)運蛋白相關(guān)的基因，發(fā)現(xiàn)八個基因在大腸癌病人腫瘤組織以及正常殘端的的表達譜不一，其中SLC7A22A基因表達異常增高，SLC7A2、2B、SLC7A4、SLC3A2、SLC7A6、SLC6A14基因表達異常降低，且具有顯著差異。本課題主要結(jié)論：
　　 1.大腸癌患者血清中L-精氨酸和L-瓜氨酸的含量較正常人低，而大腸癌患者的腫瘤組織中L-精氨酸和L-瓜氨酸的含量較其在大腸癌