體外沖擊波對肌腱細(xì)胞增殖活性影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：有關(guān)肌腱愈合機(jī)制的研究已有很多報(bào)道，由于在體內(nèi)的研究受很多因素影響，因而已有不少的研究在體外進(jìn)行。至今對肌腱細(xì)胞及成纖維細(xì)胞參與肌腱愈合的機(jī)制尚不完全清楚。自Dehm1971年體外培養(yǎng)雞胚肌腱細(xì)胞成功以來，對肌腱細(xì)胞的研究逐步深入，其生物學(xué)特性也逐步被認(rèn)識。而體外沖擊波對于很多肌腱末端病來說是一種有效的、無創(chuàng)的方法，并取得很好的臨床效果，然而很多機(jī)制尚未清楚。本研究旨在應(yīng)用激光共聚焦顯微鏡對細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)觀察以及通過對細(xì)胞增殖及對細(xì)

2、胞代謝物TGF-β、Ⅰ型膠原等的檢測，反應(yīng)何種方式體外沖擊波能對肌腱細(xì)胞的具體代謝影響，為沖擊波質(zhì)量肌腱末端疾病提供新的理論依據(jù)。
　　 方法：本研究取新西蘭大白兔后肢屈肌腱進(jìn)行原代培養(yǎng)；傳代培養(yǎng)后分為A組（ESW干預(yù)組）、B組（未干預(yù)組）；經(jīng)最適能流密度（0.36mj/m㎡，200頻次）干預(yù)后，采用共聚焦顯微鏡熒光染色對其進(jìn)行形態(tài)觀察；然后對其采用MTT比色法檢測A、B兩組不同時間點(diǎn)的OD值，比較細(xì)胞的增殖差異；在24小時、4

3、8小時、72小時、1周四個不同時間點(diǎn)應(yīng)用ELISA法分別檢測細(xì)胞iNOs、MMP-1、Col-I的值；采用RT-PCR法結(jié)合光密度相對值半定量分析沖擊波干預(yù)后48小時Col-ImRNA表達(dá)量的差異。對上述各部分?jǐn)?shù)據(jù)采用相應(yīng)的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法進(jìn)行分析。
　　 結(jié)果：
　　 1.組織塊置入培養(yǎng)瓶后，倒置顯做鏡下觀察，最早第3天見組織塊周邊有腱細(xì)胞里放射狀爬出，與維織塊邊緣垂直，并向遠(yuǎn)處貼壁生長，并呈圓形，具有折光性，最遲在第5天就

4、有細(xì)胞從組織塊周邊爬出；消化法培養(yǎng)的細(xì)胞，48h開始貼壁.后逐漸延展為梭形和多角形。在第10天左右細(xì)胞即融合成單層，細(xì)胞間的間隙非常小，可以傳代；在熒光染色核之后用共聚焦顯微鏡觀察，其密度大，有的地方細(xì)胞有疊加；從高倍視野中可以清楚的看出細(xì)胞長梭行的形態(tài)結(jié)構(gòu)。傳代后干預(yù)組的細(xì)胞在細(xì)胞數(shù)量和形態(tài)上的發(fā)展均快于對照組，在用hoechst33342染核后的觀察中也發(fā)現(xiàn)干預(yù)組比空白對照組的密度高。72小時以后，細(xì)胞漸漸伸出偽足，成多角形。

5、>　　 2.MTT法檢測發(fā)現(xiàn)，經(jīng)ESW（0.36mj/m㎡，200頻次）干預(yù)后，在24小時、48小時、72小時、1周后4個時間段時間點(diǎn)均檢測其OD值，前3個時間點(diǎn)對照組均高于其余各時間點(diǎn)，具有顯著性差異（P<0.05），說明ESW干預(yù)對于肌腱細(xì)胞早期的增殖速度和數(shù)量都有明顯的促進(jìn)作用；
　　 3.ELISA法檢測結(jié)果，A、B兩組細(xì)胞經(jīng)ESW干預(yù)24小時、48小時、72小時、1周后4個時間段收集培養(yǎng)上清分別檢測細(xì)胞iNOs、MM

6、P-1、Col-I的值，各時間點(diǎn)（除1周時間點(diǎn)）對照組均高于實(shí)驗(yàn)組，有顯著性差異（P<0.05）；
　　 4.Col-1mRNA的表達(dá)，ESW干預(yù)后48小時，A、B兩組均檢測到Col-1mRNA表達(dá)，后期表達(dá)均逐漸增強(qiáng)，A組明顯強(qiáng)于B組；肌腱膠原在整個生長過程中均表達(dá)，但是在ESW干預(yù)后48小時達(dá)到峰值，72小時后進(jìn)入平臺期。
　　 結(jié)論：
　　 1、適當(dāng)強(qiáng)度的ESW可促進(jìn)肌腱細(xì)胞增殖；
　　 2、預(yù)實(shí)驗(yàn)

7、對沖擊波干預(yù)的能級及頻次的篩選是實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵步驟；
　　 3、體外沖擊波在早期對肌腱細(xì)胞代謝具有明顯的促進(jìn)作用，iNOs、TGF-β等一系列表達(dá)產(chǎn)物明顯增強(qiáng)，從而促進(jìn)了膠原蛋白的合成，初步證明了肌腱的早期愈合跟TGF-β等代謝物分泌增強(qiáng)有關(guān)，然而實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了在這些因子增加的同時MMP-1也在早期增加，可能在早期抑制細(xì)胞增長，而后期將對細(xì)胞的重塑發(fā)揮重要作用。
　　 4、本研究結(jié)果表明，體外沖擊波促進(jìn)肌腱細(xì)胞增殖的原因可能是