NDRG2在人甲狀腺髓樣癌中的表達(dá)及其功能的初步研究.pdf

1、甲狀腺癌是內(nèi)分泌系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，其中約5％左右為來(lái)源于濾泡旁細(xì)胞的甲狀腺髓樣癌。近年來(lái)，甲狀腺髓樣癌發(fā)病率在我國(guó)呈明顯上升趨勢(shì)，徹底闡明其發(fā)病機(jī)制并尋求有效的治療措施，是當(dāng)今醫(yī)學(xué)界亟待攻克的一項(xiàng)重要課題。手術(shù)切除仍是目前臨床甲狀腺髓樣癌的首選治療方式，包括全甲狀腺切除和中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)清除，但復(fù)發(fā)率及患者的遠(yuǎn)期生存率并未得到較大的提高。內(nèi)放射治療即放射性核素治療，其中131I內(nèi)放療是最有效的輔助治療方法，主要用于原發(fā)灶切除不徹底、局部

2、復(fù)發(fā)或有轉(zhuǎn)移和不能手術(shù)切除的癌腫，可延長(zhǎng)生存期。但對(duì)于失分化甲狀腺癌及甲狀腺髓樣癌，因其細(xì)胞攝碘水平極低而療效欠佳。如何提高131I內(nèi)放射治療的效果是是臨床亟待解決的問(wèn)題。
　　鈉碘轉(zhuǎn)運(yùn)體（Sodiumiodidesymporter，NIS）是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的存在于正常甲狀腺濾泡膜上的一種糖化膜蛋白，其特異性介導(dǎo)碘離子進(jìn)入甲狀腺細(xì)胞，是甲狀腺激素合成的第一限速步驟；有研究表明，NIS介導(dǎo)的碘離子主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程與Na+/K+-ATPase

3、有著密切的聯(lián)系；借助Na+/K+-ATPase主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)形成的Na+濃度階差，Na+順電化學(xué)梯度內(nèi)流時(shí)，I-與Na+以1∶2偶聯(lián)方式經(jīng)NIS介導(dǎo)進(jìn)入甲狀腺細(xì)胞。有文獻(xiàn)報(bào)道外源性hNIS基因?qū)肴思谞钕偎铇影┘?xì)胞可顯著增加細(xì)胞131I的積聚率；NIS基因的克隆成功，為甲狀腺髓樣癌內(nèi)放射治療開辟了全新研究領(lǐng)域。
　　人源NDRG2基因是我校生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室最先發(fā)現(xiàn)并成功克隆的一個(gè)基因，功能學(xué)研究推測(cè)該基因?yàn)橐恍碌囊职┖蜻x基因，

4、參與細(xì)胞的增殖、分化和應(yīng)激反應(yīng)。前期的研究結(jié)果表明，NDRG2為甲狀腺腫瘤和正常甲狀腺組織的差異表達(dá)基因，可能參與甲狀腺髓樣癌的發(fā)生、發(fā)展；通過(guò)酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)尋找能與NDRG2相互作用的分子，結(jié)果篩選出3個(gè)有正確讀框的Na+/K+-ATPaseβ1的肽段；NDRG2和Na+/K+-ATPaseβ1在細(xì)胞內(nèi)存在共定位，并且可以穩(wěn)定Na+/K+ATPaseβ1蛋白、延長(zhǎng)其半衰期；NDRG2能夠促進(jìn)Na+/K+-ATPase的活性并增加其介導(dǎo)

5、的Na+轉(zhuǎn)運(yùn)。
　　先前研究提示NDRG2在甲狀腺髓樣癌發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用，特別是可能與鈉碘共轉(zhuǎn)運(yùn)體的表達(dá)及功能高度相關(guān)，進(jìn)而影響到放射性碘的攝取，本課題將對(duì)此進(jìn)行探討和驗(yàn)證。
　　目的
　　1、明確NDRG2及NIS在人甲狀腺腫瘤及正常組織中的表達(dá)模式；2、研究NDRG2在甲狀腺髓樣癌細(xì)胞中的功能及與NIS的關(guān)聯(lián)性；3、探討NDRG2對(duì)髓樣癌細(xì)胞放射性碘攝取的作用及腫瘤核素顯像研究。
　　方法
　　1

6、、運(yùn)用組織芯片技術(shù)通過(guò)免疫組織化學(xué)方法明確NDRG2及NIS在人甲狀腺腫瘤及正常組織中的表達(dá)模式及定位；2、構(gòu)建NDRG2過(guò)表達(dá)慢病毒并感染甲狀腺髓樣癌細(xì)胞TT，經(jīng)Blasticidin（殺稻瘟菌素）篩選，建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系TT-NDRG2（NDRG2過(guò)表達(dá)組）、TT-CHERRY（對(duì)照組、紅色熒光），采用RT-PCR和Western-blot檢測(cè)NDRG2過(guò)表達(dá)后對(duì)NISmRNA轉(zhuǎn)錄水平及蛋白表達(dá)水平的影響；3、對(duì)獲得的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染髓樣

7、癌細(xì)胞系進(jìn)行MTT、平板克隆形成、細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)及流式細(xì)胞周期測(cè)定和凋亡分析，明確NDRG2對(duì)髓樣癌細(xì)胞增殖、侵襲、遷移和細(xì)胞周期的影響，碘離子攝取實(shí)驗(yàn)檢測(cè)NIS高表達(dá)后對(duì)甲狀腺髓樣癌攝碘的影響；4、建立髓樣癌裸鼠成瘤模型，體外進(jìn)一步觀察NDRG2過(guò)表達(dá)對(duì)髓樣癌的增殖和侵襲能力的影響，及移植瘤99mTcO4-核素顯像情況。
　　結(jié)果
　　1、免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)結(jié)果顯示NDRG2和NIS均在正常甲狀腺組織中呈高表

8、達(dá)，在各病理類型甲狀腺腫瘤組織中呈低表達(dá)或不表達(dá)，二者的表達(dá)呈正相關(guān)趨勢(shì)，提示NDRG2和NIS有一定的相關(guān)性，在正常甲狀腺組織中，NDRG2定位于細(xì)胞胞漿、NIS定位于細(xì)胞質(zhì)膜；2、RT-PCR和Western-blot實(shí)驗(yàn)證實(shí)重組慢病毒pLenti6.3/V5-DEST-NDRG2感染可以上調(diào)甲狀腺髓樣癌細(xì)胞NDRG2的表達(dá)，并且NDRG2過(guò)表達(dá)可顯著上調(diào)甲狀腺髓樣癌細(xì)胞NISmRNA轉(zhuǎn)錄水平及蛋白表達(dá)水平；3、MTT、克隆形成實(shí)驗(yàn)

9、結(jié)果顯示TT-NDRG2組細(xì)胞增殖能力和克隆形成數(shù)均顯著低于對(duì)照組（p<0.05），表明NDRG2過(guò)表達(dá)明顯抑制甲狀腺髓樣癌細(xì)胞的增殖；細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示上調(diào)NDRG2可以顯著降低甲狀腺髓樣癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力（p<0.05），流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期結(jié)果顯示TT-NDRG2組與其它各對(duì)照相比細(xì)胞周期出現(xiàn)G1期阻滯現(xiàn)象，G0/G1期細(xì)胞明顯增加（p<0.01），S期細(xì)胞明顯減少（p<0.01），提示NDRG2通過(guò)G1期細(xì)

10、胞周期阻滯而抑制髓樣癌細(xì)胞TT的增殖；通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡，結(jié)果顯示與對(duì)照TT-CHERRY組相比（細(xì)胞凋亡率0.5％），TT-NDRG2組凋亡細(xì)胞明顯增多（細(xì)胞凋亡率19.2％，p<0.05）；碘攝取實(shí)驗(yàn)表明，TT-NDRG2組細(xì)胞攝碘迅速，約60分鐘達(dá)到攝取峰值，攝碘量較對(duì)照組高約17倍；4、裸鼠荷瘤實(shí)驗(yàn)顯示TT-NDRG2組與對(duì)照組相比，腫瘤生長(zhǎng)速度及瘤重均明顯小于對(duì)照組（p<0.01），通過(guò)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證NDRG2過(guò)表

11、達(dá)對(duì)甲狀腺髓樣癌增殖和侵襲的抑制作用，腫瘤99mTcO4-核素顯像結(jié)果表明TT-NDRG2組腫瘤部位可明顯聚集99mTcO4-，對(duì)照組腫瘤未顯像，說(shuō)明甲狀腺髓樣癌細(xì)胞系TT-NDRG2過(guò)表達(dá)后獲得99mTcO4-顯像能力。
　　結(jié)論
　　本課題揭示NDRG2在甲狀腺髓樣癌細(xì)胞的增殖和侵襲中的作用，并探索其作用的分子機(jī)制，初步在甲狀腺髓樣癌中證實(shí)了NDRG2能上調(diào)NIS基因的表達(dá)，并能使細(xì)胞增加其介導(dǎo)的碘攝取能力，為甲狀腺髓樣