羥基化吡蟲啉菌株的篩選及轉(zhuǎn)化作用研究.pdf

1、生物催化和轉(zhuǎn)化技術(shù)因其高效性、多樣性、底物專一性、區(qū)域選擇性、化學(xué)選擇性、對映選擇性以及溫和的反應(yīng)條件等特點(diǎn)，被譽(yù)為繼醫(yī)藥生物技術(shù)和農(nóng)業(yè)生物技術(shù)之后的“第三次生物技術(shù)浪潮”。本文采用微生物轉(zhuǎn)化的方法從土壤中篩選出能轉(zhuǎn)化煙堿類殺蟲劑吡蟲啉(imidacloprid，IMI)為5-羥基吡蟲啉(5-hydroxy IMI)的菌株，進(jìn)一步通過酸水解法將5-hydroxy IMI轉(zhuǎn)變?yōu)樯锘钚允荌MI 10-19倍的烯式吡蟲啉(olefin IM

2、I)，并對轉(zhuǎn)化機(jī)理作了初步研究。 采用唯一氮源篩選策略，從土壤中篩選到一株命名為NJ2的菌株，可高效轉(zhuǎn)化IMI為一種極性更大的化合物。NJ2菌株為專性好氧的革蘭氏陰性桿，有亞極生鞭毛；BioMerieuX Vitek自動(dòng)微生物分析儀鑒定為Stenotrophomonas maltophilia；16S rDNA結(jié)果分析進(jìn)一步證明了NJ2菌株在系統(tǒng)發(fā)育地位上屬于S. maltophilia。該化合物經(jīng)LC．MS和核磁共振分析確認(rèn)為

3、5-hydroxy IMI。 NJ2菌株的發(fā)酵和轉(zhuǎn)化條件的研究表明，麥芽糖、葡萄糖為最適生長碳源，蘋果酸和麥芽糖為最適酶形成碳源，乙酸鈉、乙醇為最佳比酶活氮源；蛋白胨為最適生長氮源，牛肉膏、酵母膏為最適酶形成氮源，玉米漿為最佳比酶活氮源。 在轉(zhuǎn)化液中添加5％的蔗糖可提高IMI羥基化酶活性15倍，在LB培養(yǎng)基中添加蔗糖對生長細(xì)胞轉(zhuǎn)化和靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化都沒有影響。轉(zhuǎn)化液中蔗糖的含量隨著轉(zhuǎn)化進(jìn)行不斷降低，生物量在轉(zhuǎn)化過程中不再增加

4、，推測蔗糖在轉(zhuǎn)化過程中被細(xì)菌利用并產(chǎn)生還原態(tài)的氫，如NADH。在轉(zhuǎn)化液中添加外源NADH，對酶活性沒有影響。 由于IMI在水中的溶解度只有0.6g／L，提高IMI的溶解度可以有效地提高羥基化酶的活性。在靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化液中添加對細(xì)胞毒性較小的有機(jī)溶劑如二甲基亞砜、甲酰胺、二甲基甲酰胺以增加底物溶解度。二甲基亞砜濃度介于1—3％時(shí)對IMI羥基化酶活性有一定的促進(jìn)作用，濃度再高，對IMI羥基化酶活性有抑制作用。甲酰胺和二甲基甲醐安對酶活

5、性有明顯地抑制作用。采用超聲處理底物懸液和固體投料的方法使得轉(zhuǎn)化細(xì)胞和粉末底物之間有最佳的接觸面積。以上方法都不能有效地提高IMI羥基化酶活性。 在轉(zhuǎn)化液中添加細(xì)胞色素P450酶抑制劑胡椒基丁醚(PBO)，當(dāng)轉(zhuǎn)化液中干菌重為0.35mg／mL，PBO濃度為O.1mmol／L和1mmol／L時(shí)，IMI羥基化酶活性分別被抑制50％和95％；干菌重為2mg／mL時(shí)，PBO濃度為1mmol／L，IMI羥基化酶活性抑制50％說明羥基化酶可

6、能是一種細(xì)胞色素P450酶。在細(xì)胞培養(yǎng)過程中添加細(xì)胞色素P450誘導(dǎo)劑苯巴比妥、乙醇以及烷烴羥基化酶的誘導(dǎo)劑正辛烷等進(jìn)行誘導(dǎo)，它們對IMI羥基化酶的活力的影響差異不顯著。在起始轉(zhuǎn)化液中添加5-hydroxy IMI對IMI的代謝有抑制，轉(zhuǎn)化液中5-hydroxy IMI的存在加速了產(chǎn)物的分解。NJ2菌株可代謝5-hydroxyIMI。 不含細(xì)胞的發(fā)酵液不能轉(zhuǎn)化IMI，而細(xì)胞本身可以轉(zhuǎn)化IMI，說明羥基化酶為胞內(nèi)酶。將細(xì)胞破碎后分

7、別用離心率為2000g(去除未破碎的細(xì)胞)和12000g(去除部分細(xì)胞碎片)，兩種粗提液中都能檢測出IMI羥基化酶活性，添加NADH則IMI羥基化酶活性可分別提高30％和提高10倍，說明添加外源NADH可提高IMI羥基化酶活性，該羥基化酶可能是一種依賴NADH的酶。靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化過程中添加蔗糖促進(jìn)IMI羥基化酶活性，而細(xì)胞破碎后添加蔗糖對IMI羥基化酶活性并沒有明顯的促進(jìn)作用，可能是由于靜息細(xì)胞中存在完整的蔗糖代謝系統(tǒng)，細(xì)胞代謝蔗糖提供N