NGF介導(dǎo)的Kidins220信號(hào)通路在小鼠氣道過(guò)敏性免疫反應(yīng)中的作用.pdf

1、目的：支氣管哮喘(bronchial asthma,簡(jiǎn)稱哮喘)是由多種細(xì)胞和細(xì)胞組分參與的反復(fù)發(fā)作的可逆性的氣流受限和氣道高反應(yīng)性為特征的氣道慢性非特異性炎癥性疾病。我國(guó)哮喘發(fā)病率為1％,其中兒童達(dá)3％。神經(jīng)生長(zhǎng)因子(nerve growth factor,NGF)在炎癥反應(yīng)中起重要作用,是調(diào)控神經(jīng)源性炎癥關(guān)鍵的細(xì)胞因子,可通過(guò)連接神經(jīng)系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)而發(fā)揮放大氣道炎癥的作用。許多研究表明NGF參與哮喘發(fā)病,它通過(guò)與其高親和力受體-酪氨酸

2、激酶受體A(tyrosine kinase receptor A,TrkA)及低親和力受體P75結(jié)合在氣道炎癥、氣道高反應(yīng)性和氣道重塑中起重要作用。近年來(lái)支氣管哮喘與細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)的研究一直受到國(guó)內(nèi)外學(xué)者的普遍關(guān)注。越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)哮喘發(fā)生不僅僅與免疫炎癥相關(guān),同時(shí)神經(jīng)系統(tǒng)也參與了哮喘的發(fā)病。但對(duì)于他們之間的相互作用及其機(jī)制尚不完全清楚。
　　 Kinase D-interacting substrate of220kDa(KJ

3、dins220),又稱作ankyrin repeat-richmembrane spanning protein(ARMS),是一個(gè)跨膜支架蛋白,屬大蛋白,包含大量的蛋白連接區(qū)域,與三種Trk受體和P75受體通過(guò)跨膜區(qū)域相互作用。ARMS的作用之一是招募蛋白或受體酶作用底物,ARMS作為蛋白激酶D/Kidins220作用底物,是一種新奇的Trk受體酪氨酸激酶下游蛋白。Kidins220經(jīng)常與Trk和P75共表達(dá)形成三元復(fù)合物,是唯一的與

4、兩種受體相聯(lián)系的膜蛋白。ARMS在神經(jīng)細(xì)胞正常高表達(dá),這提示神經(jīng)功能需要一定的ARMS蛋白調(diào)節(jié)和維持。一系列的銜接蛋白與Trk連接促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)多種信號(hào)通路,在這些信號(hào)通路中,MAPK持續(xù)激活是神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)信號(hào)通路獨(dú)有的特征。Trk的跨膜區(qū)域和ARMS聯(lián)系。Trk和ARMS的相互作用導(dǎo)致MAP激酶活性增加持續(xù)數(shù)小時(shí),所以說(shuō)ARMS作為支架蛋白直接參與和調(diào)節(jié)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子信號(hào)通路。NGF介導(dǎo)的TrkA通路參與哮喘發(fā)病,ARMS參與這條信號(hào)通路的調(diào)節(jié)

5、,那么,ARMS有可能也參與哮喘發(fā)病機(jī)制,也是哮喘治療的一個(gè)靶點(diǎn)。
　　 本研究旨在觀察小鼠氣道過(guò)敏性免疫反應(yīng)過(guò)程中NGF介導(dǎo)的Kidins220信號(hào)通路是否被激活。研究NGF及TrkA被阻斷后,對(duì)Kidins220/ARMS表達(dá)的影響;研究Kidins220/ARM被阻斷后,對(duì)哮喘小鼠氣道炎癥和氣道高反應(yīng)性的作用,及對(duì)NF-κB表達(dá)的影響。有利于進(jìn)一步闡明NGF介導(dǎo)的參與哮喘發(fā)病的信號(hào)機(jī)制,闡明Kidins220/ARMS信號(hào)

6、通路是否參與哮喘發(fā)病,為開(kāi)辟哮喘治療的新途徑提供理論依據(jù)。
　　 材料和方法：
　　 1、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的分組清潔級(jí)雌性BALB/c小鼠90只,6-8周齡,體重18-20克,購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所。按隨機(jī)數(shù)字表法分為5組:(1)PBS對(duì)照組(n=18);(2)哮喘模型組(n=18);(3)anti-NGF抗體組(n=18);(4)anti-TrkA抗體組(n=18);(5)anti-ARMS抗體組(n=18)。

7、>　　 2、小鼠哮喘模型的制備實(shí)驗(yàn)第1天,哮喘組、anti-NGF抗體組、anti-TrkA抗體組、anti-ARMS抗體組小鼠腹腔注射20pg卵蛋白(ovalbumin,OVA)和2mg氫氧化鋁混合于0.5ml磷酸鹽緩沖液(PBS)中;實(shí)驗(yàn)第8,15,22天,腹腔注射10μgOVA和1mg氫氧化鋁混合于0.5ml磷酸鹽緩沖液(PBS)中;實(shí)驗(yàn)第23天開(kāi)始,給予4％OVA(PBS配制)霧化吸入,每天一次,每次25-30分鐘至喘息發(fā)作,

8、連續(xù)7天,anti-NGF抗體組,anti-TrkA抗體組及anti-ARMS抗體組在每次霧化吸入OVA前3小時(shí)通過(guò)鼻腔分別給予anti-NGF抗體,anti-TrkA抗體及anti-ARMS抗體干預(yù)。PBS對(duì)照組以PBS代替OVA腹腔注射及霧化吸入,其余均與哮喘組相同。
　　 3、氣道反應(yīng)性測(cè)定最后一次吸入OVA24小時(shí)后開(kāi)始檢測(cè)氣道反應(yīng)性。采用梯度濃度的乙酰甲膽堿(methacholine,MCH)激發(fā)氣道高反應(yīng),應(yīng)用Ani

9、Res2005動(dòng)物肺功能分析系統(tǒng)檢測(cè)氣道阻力(吸氣阻力和呼氣阻力)。
　　 4、支氣管肺泡灌洗液(bronchial alveolar larvage fluid,BALF)的檢測(cè)BALF進(jìn)行細(xì)胞總數(shù)計(jì)數(shù)及分類細(xì)胞計(jì)數(shù),酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELIASA)檢測(cè)BALF上清中TNF-α、IL-1β、IL-4的表達(dá)水平。BALF細(xì)胞涂片應(yīng)用免疫熒光檢測(cè)kidins220及TrkA的表達(dá)。
　　 5、蘇木素-伊紅(HE)染色觀察肺

10、組織病理學(xué)變化各組小鼠肺組織常規(guī)固定、石蠟包埋、相同位置切片,HE染色,光鏡下觀察及圖像分析。
　　 6、實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR定量檢測(cè)實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR定量檢測(cè)肺組織中Kidins220 mRNA、IL-1β mRNA、IL-4mRNA、FNF-αmRNA含量及統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。
　　 7、免疫印跡(Westem blot)檢測(cè)Western blot檢測(cè)肺組織kidins220、NGF、TrkA、CrkL的表達(dá),圖

11、像分析及數(shù)據(jù)處理。
　　 8、凝膠電泳遷移率實(shí)驗(yàn)(electrophoretic mobility shift assay,EMSA)EMSA檢測(cè)各組肺組織NFκB結(jié)合活性及統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。
　　 9、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理所有原始數(shù)據(jù)采用SPSS15.0軟件分析,所有結(jié)果均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((-x)+SD)表示,樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)方法,正態(tài)分布及方差齊時(shí),兩兩比較采用LSD檢驗(yàn);非正態(tài)分布采用秩

12、和檢驗(yàn);而氣道阻力的比較采用多因素方差分析(two-way ANOVA)。P＜0.05為差異有顯著性。
　　 結(jié)果：
　　 1、支氣管和肺組織病理學(xué)觀察結(jié)果正常對(duì)照組小鼠支氣管及肺泡結(jié)構(gòu)基本正常,支氣管壁無(wú)明顯炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。哮喘組小鼠支氣管管腔狹窄、管壁增厚,支氣管壁內(nèi)及管周、周圍血管及肺泡內(nèi)可見(jiàn)淋巴細(xì)胞及嗜酸粒細(xì)胞等炎性細(xì)胞浸潤(rùn),提示小鼠哮喘模型建模成功。Anti-NGF抗體組、anti-TrkA抗體組、anti-AR

13、MS抗體組小鼠支氣管和肺組織病理改變程度較哮喘組明顯減輕。
　　 2、氣道反應(yīng)性測(cè)定及分析結(jié)果哮喘小鼠對(duì)MCH的氣道反應(yīng)性比正常對(duì)照組明顯增強(qiáng)(P＜0.01),表明小鼠哮喘模型建模成功。而給與anti-NGF抗體、anti-TrkA抗體、anti-ARMS抗體阻斷后,氣道反應(yīng)性較哮喘組明顯改善。
　　 3、BALF細(xì)胞總數(shù)計(jì)數(shù)、分類細(xì)胞計(jì)數(shù)及分析結(jié)果哮喘組細(xì)胞總數(shù)及嗜酸性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等炎癥細(xì)胞數(shù)明顯高于正常對(duì)照組(P

14、＜0.01),而給與anti-NGF抗體、anti-TrkA抗體、anti-ARMS抗體阻斷后,炎癥細(xì)胞數(shù)較哮喘組明顯減少(P＜0.01或P＜0.05)。
　　 4、實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR定量檢測(cè)肺組織中Kidins220 mRNA、IL-1β mRNA、IL-4 mRNA、TNF-α mRNA的表達(dá)及分析結(jié)果哮喘組Kidins220 mRNA、IL-1β mRNA、IL-4 mRNA、TNF-β mRNA表達(dá)量明顯高于正常對(duì)

15、照組(P＜0.01或P＜0.05),給予anti-ARMS抗體阻斷后,IL-1βmRNA、IL-4 mRNA、TNF-αmRNA表達(dá)量較哮喘組明顯減少(P＜0.01或P＜0.05)。
　　 5、免疫熒光檢測(cè)kidins220、TrkA的表達(dá)及分析結(jié)果支氣管灌沈液細(xì)胞涂片做免疫熒光顯示,kidins220及TrkA共表達(dá)于細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì),且哮喘組的表達(dá)強(qiáng)于正常對(duì)照組。
　　 6、ELISA檢測(cè)小鼠BALF中TNF-α、IL

16、-1β、IL-4表達(dá)及分析結(jié)果哮喘組小鼠BALF中TNF-α、IL-1β、IL-4的表達(dá)水平較正常對(duì)照組明顯升高(P＜0.01),而給與anti-NGF抗體、anti-TrkA抗體、anti-ARMS抗體阻斷后,TNF-α、IL-1β、IL-4的表達(dá)水平較哮喘組明顯降低(P＜0.01或P＜0.05)。
　　 7、Western blot檢測(cè)Kidins220、NGF、TrkA、CrkL的表達(dá)及分析結(jié)果正常對(duì)照組肺組織有Kidin

17、s220的表達(dá),且哮喘組Kidins220、NGF、TrkA、CrkL的表達(dá)明顯高于正常對(duì)照組(P＜0.01或P＜0.05);而給與anti-NGF抗體、anti-TrkA抗體阻斷后,Kidins220、CrkL的表達(dá)較哮喘組明顯降低(P＜0.01或P＜0.05);給與anti-ARMS抗體阻斷后,NGF、TrkA、CrkL的表達(dá)較哮喘組明顯降低(P＜0.01或P＜0.05)。
　　 8、EMSA檢測(cè)肺組織NFrB結(jié)合活性及分析

18、結(jié)果哮喘組NFKB結(jié)合活性明顯高于正常對(duì)照組(P＜0.01),給予anti-NGF抗體、anti-TrkA抗體、anti-ARMS抗體阻斷后,NFκB結(jié)合活性較哮喘組明顯減少(P＜0.01)。
　　 結(jié)論：
　　 1、Kidins220在小鼠正常肺組織中有表達(dá),且哮喘組明顯高于正常對(duì)照組,提示Kidins220可能參與了哮喘的發(fā)病。
　　 2、Kidins220阻斷后可以減輕哮喘小鼠氣道炎癥和氣道高反應(yīng)性,提示K

19、idins220參與哮喘氣道炎癥和氣道高反應(yīng)性的發(fā)生。
　　 3、哮喘小鼠Kidins220、NGF、TrkA表達(dá)量增加,且Kidins220和TrkA共表達(dá)于細(xì)胞膜,而采用Kidins220抗體阻斷后,NGF、TrkA表達(dá)量減少。提示Kidins220可能通過(guò)NGF-TrkA途徑參與哮喘發(fā)病。
　　 4、哮喘小鼠NFκB被激活,引起炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-4的過(guò)表達(dá);Kidins220阻斷后,NFκB結(jié)合