創(chuàng)面愈合中SDF-1的表達(dá)對表皮干細(xì)胞遷移作用的機(jī)制研究.pdf

1、皮膚作為人體最大的器官，外層的表皮終身不斷自我更新。這種更新由表皮基底層具有再生能力的角質(zhì)形成細(xì)胞分裂、增殖、分化來完成。皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞主要包括表皮干細(xì)胞(epidermalstemcell，ESC)、短暫擴(kuò)增細(xì)胞(transitAmplifyingcell,TAcell)以及終末分化細(xì)胞(postmioticdiffetrentiatingcell，PMDcell)。其中，位于表皮基底層的表皮干細(xì)胞持續(xù)增殖分化以取代外層終術(shù)分化細(xì)胞

2、，從而在維持組織結(jié)構(gòu)的更新、細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，尤其在創(chuàng)傷后創(chuàng)面修復(fù)過程中起著至關(guān)重要的作用。付小兵等[2]，通過建立動物創(chuàng)傷模型，觀察到創(chuàng)面愈合過程中，隨著時間的推移創(chuàng)緣周圍尤其是棘層或顆粒層出現(xiàn)多個散在的β-整合素(β1-intergin)及K19陽性表達(dá)的細(xì)胞，且越接近創(chuàng)面這些陽性細(xì)胞越密集；此種陽性細(xì)胞被認(rèn)為是表皮干細(xì)胞。目前，關(guān)于這種表皮干細(xì)胞在創(chuàng)緣周圍數(shù)量逐漸增多并且密集分布的具體機(jī)制并不十分清楚。 創(chuàng)傷愈合早期，創(chuàng)周

3、組織大量滲液，這些滲液中富含細(xì)胞因子、細(xì)胞外基質(zhì)及內(nèi)毒素等成分。這些細(xì)胞因子在創(chuàng)傷愈合過程中具有重要作用，它們可以調(diào)節(jié)創(chuàng)傷修復(fù)過程中的多種細(xì)胞反應(yīng)，影響細(xì)胞增殖、遷移、細(xì)胞外基質(zhì)合成和釋放等。因此我們推測很可能是由創(chuàng)周組織分泌液中的某些細(xì)胞因子成分及其位于細(xì)胞表面或胞體內(nèi)的受體共同介導(dǎo)了表皮干細(xì)胞的分布變化及數(shù)量改變，而這種改變很可能就是趨化因子及其受體介導(dǎo)的趨化效應(yīng)。 為了對表皮干細(xì)胞的在創(chuàng)緣周圍所表現(xiàn)出的分布及數(shù)量改變的機(jī)制

4、進(jìn)行初步探索，本實驗首先通過建立大鼠創(chuàng)傷模型，運(yùn)用免疫組織化學(xué)方法對創(chuàng)傷后不同時相點(diǎn)表皮干細(xì)胞的組織學(xué)分布進(jìn)行定位；ELISA檢測趨化因子SDF-1在創(chuàng)周組織中的表達(dá)情況，并觀察創(chuàng)傷條件下表皮干細(xì)胞在創(chuàng)緣的分布變化趨勢與SDF-1表達(dá)情況的相關(guān)性。其次，通過選擇兩種經(jīng)典的細(xì)胞表面標(biāo)志物-β1-intergin及角蛋白19(K19)，對體外培養(yǎng)獲得的表皮干細(xì)胞進(jìn)行鑒定；并運(yùn)用免疫熒光化學(xué)方法和流式細(xì)胞儀技術(shù)對體外培養(yǎng)的表皮干細(xì)胞表達(dá)趨化因

5、子受體CXCR4的情況進(jìn)行了檢測。最后，利用Transwell培養(yǎng)體系，觀察從燒傷患者創(chuàng)面預(yù)先收集的創(chuàng)面分泌液對表皮干細(xì)胞的體外趨化作用，并對其作用機(jī)理進(jìn)行初步探討。 具體研究方法及結(jié)果如下： 1、創(chuàng)傷后不同時相點(diǎn)大鼠表皮干細(xì)胞的組織學(xué)分布定位 采用免疫組織化學(xué)方法，結(jié)果顯示伴隨創(chuàng)面愈合進(jìn)程，表皮干細(xì)胞的定位分布不象正常皮膚那樣呈單層片狀、散在分布于表皮基底層，而是由單層逐漸增加為雙層乃至多層，特征性的改變是棘層

6、或顆粒層出現(xiàn)多個散在的β1-intergin、K19和BrdU滯留劑標(biāo)記陽性細(xì)胞，且越接近創(chuàng)面這些陽性細(xì)胞更加密集，其數(shù)量隨著創(chuàng)面的縮小漸逐增加，至創(chuàng)面愈合、上皮化，這些陽性細(xì)胞仍然存在。組織形態(tài)學(xué)上表現(xiàn)為新生表皮組織較正常組織明顯增厚。 2、創(chuàng)緣周圍組織SDF-1的表達(dá)情況檢測 酶聯(lián)免疫吸附檢測法(ELISA)檢測創(chuàng)緣周圍組織勻漿上清中SDF-1的表達(dá)情況。以正常組織勻漿上清作為對照組。 創(chuàng)緣周圍組織中SDF-

7、1在傷后24h天開始逐漸表達(dá)，其表達(dá)量隨著創(chuàng)面愈合進(jìn)程呈上升趨勢，于創(chuàng)傷后第7天達(dá)到各檢測時相點(diǎn)的最高值；對照組中SDF-1呈微量表達(dá)，伴隨創(chuàng)面愈合進(jìn)程組間各組SDF-1變化未見顯著差異。 3、人表皮干細(xì)胞的分離培養(yǎng)及鑒定 獲取5～15歲行包皮環(huán)切術(shù)的年輕患者術(shù)后的包皮組織，利用中性蛋白酶和胰酶兩步分離法以及表皮干細(xì)胞對IV型膠原的快速黏附對細(xì)胞進(jìn)行篩選，篩選出的干細(xì)胞在IV型膠原上生長良好，細(xì)胞形態(tài)均一，呈“鋪路石狀”

8、，細(xì)胞小而圓，核漿比例大，表現(xiàn)出原始細(xì)胞的形態(tài)特征，具有較高的克隆形成率、表皮干細(xì)胞表面標(biāo)記物K19、β1-integrin呈陽性表達(dá)，說明通過該方法較為成功的培養(yǎng)出人表皮干細(xì)胞。 4、人表皮干細(xì)胞表達(dá)趨化因子受體CXCR4情況的檢測免疫熒光化學(xué)檢測體外培養(yǎng)表皮干細(xì)胞表達(dá)趨化因子受體CXCR4的情況；結(jié)果顯示：①細(xì)胞胞膜及胞漿內(nèi)FITC熒光染色呈陽性；②流式細(xì)胞儀檢測表皮干細(xì)胞表達(dá)趨化因子受體CXCR4的陽性百分率約為43.5％

9、。 5、創(chuàng)面分泌液的收集及其對表皮干細(xì)胞體外趨化作用的實驗研究 均取自本院燒傷研究所燒傷患者創(chuàng)面分泌液(n=6)，采用無菌操作，10ml注射器抽取創(chuàng)面分泌液或痂下積液，收集離心取上清，濾紙過濾后微型過濾器抽濾除菌，-70℃無菌保存?zhèn)溆谩?利用Transwell培養(yǎng)體系進(jìn)行體外趨化實驗結(jié)果顯示，創(chuàng)面收集液組從微孔膜上層遷移至下層的細(xì)胞數(shù)約為(87±9.12)，明顯多于CXCR4受體拮抗組(21±2.71)和K-SF

10、M對照組(15±3.28)(P＜0.05)。受體拮抗組稍多于K-SFM對照組，但無顯著差異(P＞0.05)。 通過以上實驗結(jié)果我們可以初步得出結(jié)論： 1、創(chuàng)傷條件下SD大鼠表皮干細(xì)胞分布發(fā)生改變，不僅位于于表皮基底層，且在創(chuàng)緣周圍呈密集分布并伴有數(shù)量增多的趨勢。 2、SD大鼠創(chuàng)緣周圍組織中SDF-1大量表達(dá)，伴隨創(chuàng)面愈合進(jìn)程呈逐漸升高的趨勢直至創(chuàng)面愈合；而創(chuàng)面對側(cè)正常皮膚組織中SDF-1呈微量表達(dá)，在創(chuàng)面愈合過程