桂苓消異方含藥血清對(duì)子宮內(nèi)膜異位癥在位內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞凋亡及NF-κB活性的影響.pdf

1、子宮內(nèi)膜異位癥是一種常見(jiàn)的良性婦科病變，其特征在于子宮內(nèi)膜的腺上皮細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞存在于子宮腔以外的部位，臨床上常見(jiàn)的部位有卵巢、輸卵管、膀胱、子宮肌層等。它所引起的痛經(jīng)、慢性盆腔痛和不孕等嚴(yán)重影響了中青年婦女的健康和生活質(zhì)量，也日益受到人們的關(guān)注。因其發(fā)病機(jī)制未明，治療的針對(duì)性不強(qiáng)，該病的診治依然困擾著婦產(chǎn)科的專家學(xué)者們。
　　本實(shí)驗(yàn)通過(guò)體外分離培養(yǎng)人子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞來(lái)研究桂苓消異方治療子宮內(nèi)膜異位癥的微觀作用機(jī)理，通過(guò)制備藥物血

2、清了解桂苓消異方對(duì)體外培養(yǎng)的基質(zhì)細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞早期凋亡及細(xì)胞NF-κB的活性的作用。由于已有證據(jù)表明桂苓消異方對(duì)體外培養(yǎng)的內(nèi)異癥患者的在位子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞上清液中表達(dá)的IL-8有抑制作用[1]，本實(shí)驗(yàn)以此為基礎(chǔ)進(jìn)一步研究IL-8的表達(dá)是否會(huì)受基質(zhì)細(xì)胞NF-κB活性的影響，以探討桂苓消異方含藥血清能否通過(guò)降低NF-κB的活性來(lái)抑制IL-8的分泌，為臨床上此方治療子宮內(nèi)膜異位癥提供理論支持。
　　1、桂苓消異方治療子宮內(nèi)膜異位癥的中醫(yī)

3、理論基礎(chǔ)
　　中醫(yī)學(xué)古籍中并未記載子宮內(nèi)膜異位癥病名，將其歸于“痛經(jīng)”、“不孕”、“癥瘕”、“月經(jīng)不調(diào)”等范疇。目前多數(shù)學(xué)者認(rèn)為此病的治療應(yīng)當(dāng)從溫腎化瘀著手，腎虛是發(fā)生本病的根本，血瘀是其重要的致病因素和病理表現(xiàn)。
　　桂苓消異方是導(dǎo)師在張仲景《金匱要略》中記載的桂枝茯苓丸基礎(chǔ)上去蜂蜜，加仙靈脾、血竭粉而成。桂枝茯苓丸本來(lái)是用于治療妊娠之后癥積害胎者，導(dǎo)師加用仙靈脾和血竭粉增強(qiáng)了原方溫腎、祛瘀的力量，臨床觀察此方用于內(nèi)異癥的

4、治療效果顯著。本課題用桂苓消異方含藥血清對(duì)人子宮內(nèi)膜異位癥在位內(nèi)膜細(xì)胞進(jìn)行體外研究，為桂苓消異方的臨床應(yīng)用提供了理論依據(jù)。
　　2、分離純化體外培養(yǎng)人子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞
　　收集2011年9月至2012年5月因子宮內(nèi)膜異位癥在揚(yáng)州市第一人民醫(yī)院婦產(chǎn)科采取手術(shù)治療的患者的在位子宮內(nèi)膜作為實(shí)驗(yàn)組，同時(shí)收集診斷為非內(nèi)異癥且開(kāi)腹或腹腔鏡術(shù)后病理提示為正常的內(nèi)膜作為對(duì)照組，兩組內(nèi)膜術(shù)后病理提示分別為內(nèi)異癥和正常子宮內(nèi)膜。對(duì)收集的內(nèi)膜標(biāo)本

5、分離培養(yǎng)基質(zhì)細(xì)胞，視細(xì)胞生長(zhǎng)情況進(jìn)行傳代，并利用免疫組化法鑒定細(xì)胞純度。根據(jù)經(jīng)驗(yàn)，選取術(shù)前B超提示內(nèi)膜厚度至少為5mm的患者作為采集對(duì)象。
　　結(jié)果顯示，在現(xiàn)有的實(shí)驗(yàn)條件下并結(jié)合參考查閱文獻(xiàn)，以膠原酶消化、篩網(wǎng)分離為主要實(shí)驗(yàn)方法，人子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞的分離培養(yǎng)及傳代情況良好。實(shí)驗(yàn)觀察基質(zhì)細(xì)胞可傳4-5代，傳代后的細(xì)胞活性及生長(zhǎng)情況未因傳代受明顯影響。通過(guò)實(shí)驗(yàn)后統(tǒng)計(jì)分析，發(fā)現(xiàn)在本實(shí)驗(yàn)條件下內(nèi)異癥與非內(nèi)異癥內(nèi)膜均可分離培養(yǎng)成功，取材時(shí)內(nèi)

6、膜所處的月經(jīng)周期對(duì)細(xì)胞的成活率無(wú)明顯影響。成功分離培養(yǎng)出子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞為下一步的實(shí)驗(yàn)提供了良好的平臺(tái)。
　　3、桂苓消異方對(duì)子宮內(nèi)膜異位癥在位內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞早期凋亡的影響
　　制備桂苓消異方藥物血清，同時(shí)設(shè)空白組和西藥對(duì)照組，用藥物血清干預(yù)內(nèi)異癥患者的在位子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞，觀察藥物影響下細(xì)胞的形態(tài)變化，并在檢測(cè)細(xì)胞凋亡前收集24、48、72h三個(gè)時(shí)間段細(xì)胞培養(yǎng)的上清液，留待下一步檢測(cè);流式細(xì)胞儀技術(shù)檢測(cè)不同血清濃度對(duì)子宮內(nèi)膜

7、異位癥在位內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞作用24、48、72h后細(xì)胞早期凋亡的影響。
　　4、子宮內(nèi)膜異位癥中NF-κB、IL-8的相關(guān)性探討及桂苓消異方對(duì)內(nèi)異癥患者在位內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞NF-κB活性的影響
　　用不同濃度的TNF-α，TNF-α+PDTC干預(yù)原代培養(yǎng)的人子宮內(nèi)膜異位癥在位內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞，觀察細(xì)胞形態(tài)的變化，并收集培養(yǎng)24h后的細(xì)胞培養(yǎng)上清液，通過(guò)ELISA法檢測(cè)上清液中NF-κB活性、IL-8濃度，利用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法分析兩者之間的相關(guān)

8、性。
　　ELISA法檢測(cè)上一步實(shí)驗(yàn)中收集的藥物血清作用后的內(nèi)異癥患者基質(zhì)細(xì)胞上清液中的NF-κB活性。
　　通過(guò)ELISA定量檢測(cè)表明，在經(jīng)TNF-α，TNF-α+PDTC處理過(guò)的內(nèi)異癥基質(zhì)細(xì)胞上清液中IL-8的表達(dá)與NF-κB的活性具有相關(guān)性，說(shuō)明子宮內(nèi)膜異位癥中的IL-8的表達(dá)可能與NF-κB途徑相關(guān);同時(shí)檢測(cè)的數(shù)據(jù)表明桂苓消異方含藥血清能降低內(nèi)異癥患者在位子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞上清液中的NF-kB的活性。因前期研究已表明桂