內(nèi)異消對(duì)子宮內(nèi)膜異位癥大鼠血管生成與雌激素的影響研究.pdf

1、子宮內(nèi)膜異位癥(endometriosis，以下簡(jiǎn)稱(chēng)內(nèi)異癥)是育齡婦女最常見(jiàn)的疾病，在一般人群中的發(fā)病率為10～15％[1]。內(nèi)異癥的發(fā)病機(jī)制尚不明確[2]，目前主要的治療方式是采用手術(shù)移除異位病灶和雌激素治療，但這些治療通常會(huì)有副作用大且易復(fù)發(fā)的缺點(diǎn)。內(nèi)異消緩釋膠囊是本課題組自行研制的抗子宮內(nèi)膜異位癥的中藥新藥，由川芎嗪、阿魏酸、延胡索乙素組成，其處方與制備工藝已經(jīng)申報(bào)國(guó)家技術(shù)發(fā)明號(hào)利。
　　 目的：
　　 本實(shí)驗(yàn)主要

2、研究?jī)?nèi)異消對(duì)大鼠子宮內(nèi)膜異位癥模型血管生成與雌激素的影響及相關(guān)機(jī)制，為將內(nèi)異消研制成為治療子宮內(nèi)膜異位癥的中藥新藥提供試驗(yàn)依據(jù)。
　　 方法：
　　 1.造模及模型成功判斷標(biāo)準(zhǔn)
　　 采用子宮內(nèi)膜自體移植法建立大鼠子宮內(nèi)膜異位癥模型，以移植物的體積大小、形態(tài)及病理檢查作為模型成功的依據(jù)。以同時(shí)符合以下3條標(biāo)準(zhǔn)者為成功模型：①移植物體積增大，被結(jié)締組織或大網(wǎng)膜覆蓋并有血管形成，呈隆起透亮的小囊狀，出現(xiàn)液體積聚，且積

3、液高度≥2 mm；②游標(biāo)卡尺測(cè)量移植物的體積大小，異位組織體積=0.52×長(zhǎng)×寬×高[4]，移植物體積≥8 mm3；③切取移植物送檢，證實(shí)移植物中有子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞、腺體及間質(zhì)的生長(zhǎng)。
　　 2.分組及給藥
　　 除正常對(duì)照組以外，將造模成功的SD大鼠隨機(jī)分為模型對(duì)照組、孕三烯酮0.5 mg·kg-1·d-1組、內(nèi)異消0.045 g·kg-1·d-1組，0.09 g·kg-1·d-1組，0.18 g·kg-1·d-1組，

4、每組各10只，于模型成功后第4 d開(kāi)始灌胃給藥，每天1次，連續(xù)4wk。
　　 3.內(nèi)異消抑制子宮內(nèi)膜異位癥大鼠血管生成作用觀(guān)察
　　 給藥4 wk后，擇動(dòng)情期處死大鼠，觀(guān)察移植物的生長(zhǎng)情況，取在位和異位子宮內(nèi)膜，進(jìn)行HE染色病理檢查觀(guān)察。免疫組化和 Western Blot方法檢測(cè)異位內(nèi)膜組織中微血管密度(MVD)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)和內(nèi)皮抑素(endostatin)蛋白的表達(dá)，放射免疫分析法(RIA)檢測(cè)大鼠

5、血清和異位內(nèi)膜組織中前列腺素E2(PGE2)的含量。
　　 4.內(nèi)異消對(duì)子宮內(nèi)膜異位癥大鼠雌激素影響的研究
　　 參照前面所述方法建立大鼠子宮內(nèi)膜異位癥模型以及進(jìn)行分組，每組各16只，于模型成功后第4 d開(kāi)始灌胃給藥，每天1次，連續(xù)10 wk。分別于給藥第4 wk末、10 wk末各處死大鼠8只，取大鼠下丘腦、垂體、卵巢、血清、在位和異位子宮內(nèi)膜。免疫組化檢測(cè)下丘腦中促性腺激素釋放激素(GnRH)，垂體中促卵泡激素(FSH

6、)和黃體生成激素(LH)，卵巢中雌激素受體(ER)的表達(dá)，Western Blot檢測(cè)異位內(nèi)膜組織中ER、熱休克蛋白90(HSP90)和環(huán)氧合酶-2(COX-2)的表達(dá)，化學(xué)發(fā)光免疫分析法(CLIA)和酶聯(lián)免疫吸附法(Elisa)分別檢測(cè)大鼠血清中雌二醇(E2)和孕酮(P)的含量。
　　 結(jié)果：
　　 1.造模結(jié)果
　　 造模4 wk后，擇動(dòng)情期開(kāi)腹觀(guān)察移植物生長(zhǎng)情況，并用游標(biāo)卡尺測(cè)量移植物大小。結(jié)果顯示，肉眼觀(guān)

7、察可見(jiàn)移植物被脂肪組織覆蓋并有血管生成，呈隆起透亮或黑色的小囊狀，出現(xiàn)液體積聚，體積增大，造模成功率為90.91％；HE染色結(jié)果顯示模型組大鼠異位內(nèi)膜組織腺體上皮細(xì)胞呈高柱狀，排列在囊泡內(nèi)腔面，細(xì)胞核大呈多層細(xì)胞排列，而正常對(duì)照組子宮內(nèi)膜細(xì)胞呈松散排列，上皮細(xì)胞薄。
　　 2.內(nèi)異消抑制子宮內(nèi)膜異位癥大鼠血管生成作用
　　 連續(xù)給藥4 wk后，比較給藥前后移植物體積大小的變化，結(jié)果顯示內(nèi)異消3個(gè)劑量組給藥后移植物體積比給

8、藥前明顯減小(P<0.01)，均能顯著抑制異位內(nèi)膜組織體積的增生；HE染色結(jié)果顯示內(nèi)異消組異位內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞層明顯變薄，細(xì)胞呈矮柱狀甚至扁平狀，單層細(xì)胞松散排列。
　　 免疫組化和Western Blot結(jié)果顯示模型組異位內(nèi)膜組織中MVD和VEGF蛋白的表達(dá)顯著高于正常對(duì)照組(P<0.01)，內(nèi)異消0.09 g·kg-1、0.18 g·kg-1均能顯著降低內(nèi)異癥大鼠MVD和VEGF蛋白的表達(dá)(P<0.05，P<0.01)；

9、>　　 模型組異位內(nèi)膜組織中endostatin蛋白的表達(dá)顯著低于正常對(duì)照組(P<0.01)，內(nèi)異消0.18 g·kg-1能極顯著升高內(nèi)異癥大鼠endostatin蛋白的表達(dá)(P<0.01)；
　　 RIA結(jié)果顯示模型組大鼠血清和異位內(nèi)膜組織中PGE2的含量明顯高于正常對(duì)照組(P<0.01)，內(nèi)異消0.09 g·kg-1、0.18 g·kg-1均能顯著降低內(nèi)異癥大鼠血清和異位內(nèi)膜組織中PGE2的含量(P<0.05，P<0.01

10、)。
　　 3.內(nèi)異消對(duì)子宮內(nèi)膜異位癥大鼠雌激素的影響
　　 連續(xù)給藥4 wk后，免疫組化結(jié)果顯示模型組大鼠下丘腦中GnRH、垂體中FSH和LH、卵巢中 ER的表達(dá)極顯著高于正常對(duì)照組(P<0.01)；化學(xué)發(fā)光法結(jié)果顯示模型組大鼠血清中E2的含量顯著高于正常對(duì)照組(P<0.01)，內(nèi)異消0.045g·kg-1、0.09 g·kg-1、0.18 g·kg-1能顯著降低大鼠血清中E2的含量(P<0.05，P<0.01)。

11、r>　　 連續(xù)給藥10 wk后，免疫組化結(jié)果顯示模型組大鼠下丘腦中GnRH、垂體中FSH和LH、卵巢中ER的表達(dá)極顯著高于正常對(duì)照組(P<0.01)，內(nèi)異消0.09 g·kg-1、0.18 g·kg-1均能顯著降低下丘腦中GnRH的表達(dá)、垂體中FSH和LH的表達(dá)、卵巢中ER的表達(dá)(P<0.05，P<0.01)；
　　 酶聯(lián)免疫法結(jié)果顯示模型組大鼠血清中P的含量極顯著低于正常對(duì)照組(P<0.01)，內(nèi)異消0.09 g·kg-1、

12、0.18 g·kg-1均能顯著增高大鼠血清中P的含量(P<0.05，P<0.01)；
　　 免疫組化和Western Blot結(jié)果顯示模型組大鼠異位內(nèi)膜組織中ER，HSP90和COX-2的表達(dá)極顯著高于正常對(duì)照組(P<0.01)，內(nèi)異消0.045 g·kg-1、0.09 g·kg-1、0.18 g·kg-1均能顯著降低ER和HSP90蛋白的表達(dá)(P<0.05，P<0.01)，內(nèi)異消0.09g·kg-1、0.18 g·kg-1能顯

13、著降低COX-2蛋白的表達(dá)(P<0.05，P<0.01)。
　　 結(jié)論：
　　 1.內(nèi)異消具有抗子宮內(nèi)膜異位癥大鼠異位組織血管生成作用，其作用機(jī)制與抑制VEGF蛋白表達(dá)和促進(jìn)endostatin蛋白的表達(dá)有關(guān)。
　　 2.內(nèi)異消能夠抑制子宮內(nèi)膜異位癥大鼠下丘腦-垂體-卵巢軸中與激素分泌相關(guān)的蛋白的表達(dá)，顯著降低子宮內(nèi)膜異位癥大鼠血清中E2的含量，顯著升高P的含量，在異位病灶處抑制雌激素的表達(dá)，從而達(dá)到降低雌激素生