釉基質(zhì)蛋白在體外對誘導(dǎo)性多能干細胞的作用及其共同在牙周再生中的應(yīng)用.pdf

1、背景和目的：牙周病治療的最終目標(biāo)是重建因炎癥過程而破壞的牙周組織，恢復(fù)其結(jié)構(gòu)和功能，即實現(xiàn)牙周組織的再生。但因牙周病喪失的牙周組織，其修復(fù)與重建的難度很大。多年來，人們一直在尋求能有效增加牙周新附著、促進牙周組織再生的治療方法，并己開展了牙周骨移植、引導(dǎo)牙周組織再生(GTR)技術(shù)等多方面的研究，取得了一定的進展，但在恢復(fù)牙周組織的生理結(jié)構(gòu)和功能上還遠未達到所期望的目標(biāo)。組織工程應(yīng)用于牙周組織缺損修復(fù)為牙周病的治療開辟了一條新途徑。

2、>　　 組織工程學(xué)的主要研究重點在于以下三個方面：(1)種子細胞的來源；(2)生物載體支架材料的選擇；(3)有效的細胞因子。要進行系統(tǒng)的牙周組織工程研究，就必須首先對以上三個問題進行探討、研究和解決。其中，選擇合適的種子細胞和有效的細胞因子是非常重要的。
　　 誘導(dǎo)性多功能干細胞(induced Pluripotent Stem cells，iPS細胞)來源于成體細胞，其獲得方法相對簡單穩(wěn)定。不需要使用生殖細胞或破壞早期胚胎。

3、在技術(shù)上和倫理上都更有優(yōu)勢。iPS細胞具有與胚胎干細胞(EmbryonicStem Cells，ESC)相似的生物學(xué)特性并能在適當(dāng)?shù)恼T導(dǎo)條件下分化為3個胚層的細胞，是具有全能分化能力的干細胞。此外，iPS細胞可由患者自身細胞誘導(dǎo)獲得，具有與患者自身相同的基因組成，不會引起機體的免疫排斥反應(yīng)。這種種特性表明iPS細胞成為理想種子細胞的可能性。
　　 以前很多研究顯示了釉基質(zhì)蛋白(enamel matrix derivates，EM

4、D)在牙周再生中的作用。EMD能夠誘導(dǎo)無細胞外源性纖維牙骨質(zhì)的再生(acellular extrinsic fiber cementum，AEFC)。無細胞性牙骨質(zhì)與牙本質(zhì)的結(jié)合較細胞性牙骨質(zhì)與牙本質(zhì)的結(jié)合更加牢固。Boyan等在實驗中發(fā)現(xiàn)EMD可能具有骨促進而不是骨誘導(dǎo)作用，但使用劑量應(yīng)達到或超過一定的閾值。在牙周組織再生的過程中，EMD可能作為一種基質(zhì)，形成與牙周組織發(fā)育時類似的微環(huán)境，通過促進成骨細胞的功能活動而有利于牙槽骨的再生

5、。
　　 本研究中，體外實驗研究iPS細胞的成骨分化和EMD對iPS細胞的誘導(dǎo)作用；體內(nèi)實驗，將iPS細胞和EMD共同用于牙周組織骨缺損的組織工程學(xué)修復(fù)，探討將其應(yīng)用于牙周再生的可行性。
　　 方法和材料：
　　 (1)使用基質(zhì)膠(Matrigel)包被培養(yǎng)皿，采用無滋養(yǎng)層的方法培養(yǎng)人的iPS細胞。RT-PCR檢測培養(yǎng)人iPS細胞中干細胞特異性基因Oct4和Nanog的表達。然后采用克隆懸浮的方法獲取擬胚體(em

6、bryoid body，EB)。
　　 (2)收集懸浮培養(yǎng)形成的EB，移入0.1％明膠處理過的培養(yǎng)板中，貼壁，并分別在普通培養(yǎng)液、加了礦化誘導(dǎo)液的培養(yǎng)液和加了EMD的培養(yǎng)液中培養(yǎng)，觀察不同的培養(yǎng)液對細胞的向成骨方向分化和體外礦化的影響。采用PCR和Real-time PCR檢測成骨相關(guān)因子和蛋白，包括Runx2，OC，BSP等的mRNA表達；分別檢測不同培養(yǎng)液中的細胞在培養(yǎng)后的第7，12，23，30天的堿性磷酸酶(alkalin

7、e phosphatase，ALP)的活性，觀察不同培養(yǎng)液中細胞在不同時間點的ALP蛋白活性；將細胞在不同培養(yǎng)液中培養(yǎng)28天后，茜素紅染色觀察其在體外形成礦化結(jié)節(jié)的能力，并分析其礦化面積所占的百分比。
　　 (3)取12.5天左右的孕鼠，原代培養(yǎng)小鼠胚胎成纖維細胞(mouse embryonic fibroblast，MEF)，使用適量γ射線照射后用于制備滋養(yǎng)層。在MEF滋養(yǎng)層上培養(yǎng)小鼠的iPS細胞，使用懸滴法獲得EB。

8、　　 (4)在裸小鼠的下頜磨牙區(qū)制作牙周骨缺損，然后使用組織工程技術(shù)修復(fù)牙周缺損。實驗分為三組：單純材料組，材料+EMD組和材料+EMD+鼠iPS細胞組，術(shù)中所用的材料為羥基磷灰石/絲復(fù)合支架材料。術(shù)后12和24天，Real-time PCR檢測三組標(biāo)本其新生骨組織的成骨相關(guān)因子和蛋白Runx2，OC，BSP，Osx的mRNA表達；對標(biāo)本進行Micro-ct檢測，立體觀察分析牙周缺損區(qū)硬組織的新生情況；組織學(xué)分析來觀察缺損處成骨，成牙

9、骨質(zhì)以及牙周修復(fù)的狀況。
　　 結(jié)果：
　　 (1)在顯微鏡下觀察，未分化的人iPS細胞呈集落樣生長，不典型的圓形或橢圓形，集落邊緣光滑清晰，有的集落邊緣可見有少量細胞分化。細胞呈團狀排列，胞核大，胞漿少，核漿比較高。克隆邊緣分化后的細胞呈梭形或多邊型，細胞核小，胞漿豐富。RT-PCR實驗結(jié)果顯示培養(yǎng)的人iPS細胞中有Oct4和Nanog的表達。鏡下可觀察到，形成的EB懸浮在培養(yǎng)液中，呈現(xiàn)為規(guī)則或不太規(guī)則的球形。中心較致

10、密，邊緣透亮。
　　 (2)RT-PCR結(jié)果顯示，細胞BSP的mRNA表達水平，EMD和普通培養(yǎng)液中相差不大，均低于礦化誘導(dǎo)液組，統(tǒng)計學(xué)上有極顯著性差異(P<0.01)。第20天時，Runx2的mRNA表達水平，EMD組高于礦化誘導(dǎo)液組和普通培養(yǎng)液組，礦化誘導(dǎo)液組又高于普通培養(yǎng)液組，且有極顯著性差異(P<0.01)。在培養(yǎng)的第30天，同樣的，EMD組仍然有最高水平的表達，且差距有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。在第20和30天時，O

11、C的mRNA表達水平，EMD組均為最低，且與其他兩組相比，均有極顯著性差異(P<0.01)；ColI的mRNA表達水平，在礦化誘導(dǎo)液組中最高，且其差異有統(tǒng)計學(xué)意義，而其余兩組差別不大。茜素紅染礦化結(jié)節(jié)的結(jié)果也發(fā)現(xiàn)，三組中，EMD實驗組生成的礦化結(jié)節(jié)也最少(P<0.01)。ALP活性檢測發(fā)現(xiàn)，在第23天左右，不同培養(yǎng)液中的細胞其ALP活性達到最大值，且EMD培養(yǎng)液中的細胞ALP活性低于另外兩組。
　　 (3)體內(nèi)動物實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，

12、在術(shù)后12天和24天，相較其它兩組而言，材料+EMD+鼠iPS細胞的動物組均有較高的OC，Osx和Runx2的mRNA基因表達(P<0.01或者<0.05)。組織學(xué)分析顯示，術(shù)后12天和24天，新生成骨的百分比，在材料+EMD對照組中與在單純材料組中的相似。在絲材料+EMD+iPS細胞實驗組中比在其他兩個組中都要高，且有顯著的統(tǒng)計學(xué)差異(p<0.01)。Micro-CT結(jié)果分析顯示在相同層次上，EMD+iPS細胞移植組的標(biāo)本比EMD組的

13、新形成的硬組織中多。使用3-D軟件將組織缺損處從CT立體圖像中切出來，也可以明顯看出實驗組的硬組織密度要比對照組高的多，這些都提示了iPS細胞實驗組中更多硬組織的生成。HE染色也顯示，術(shù)后24天，移植了iPS細胞的動物組有更多的新生骨組織和新生牙骨質(zhì)。
　　 結(jié)論：
　　 體外細胞誘導(dǎo)實驗中，EMD能很強的促進RUNX2的mRNA表達，但是卻抑制了OC的表達和體外礦化。實驗結(jié)果表明EMD可能促進間充質(zhì)前體干細胞向成骨細胞