綠僵菌脅迫下紅火蟻的防御行為及機制探討.pdf

1、社會性昆蟲營群居生活的特性，巢內頻繁的個體接觸、溫暖及高濕的生境極其有利于病原菌在巣內傳播。然而在漫長的自然進化過程中，在病原菌對社會性昆蟲的巨大的自然選擇壓力下，社會性昆蟲進化出了復雜的社會行為以防御病原菌在巣內傳播，這種進化上的優(yōu)勢為利用蟲生真菌防治社會昆蟲提出了巨大的挑戰(zhàn)。紅火蟻（Solenopsis invicta）屬于膜翅目蟻科，是一種重大入侵性社會昆蟲。為了有效利用蟲生真菌防治紅火蟻，有必要深入研究紅火蟻防御病原真菌的行為及

2、其機制，為針對性地設計蟲生真菌制劑及施用方式提供理論基礎。因此，本論文針對紅火蟻巣內不同分工的工蟻在病原真菌脅迫下的行為反應及其內在機制展開了研究，主要結果分述如下：
　　1、蟲生真菌菌株篩選
　　從白僵菌（Bb02和Bb04菌株）、綠僵菌（Ma01、SM076和M09菌株）和玫煙色棒束孢（IFCF-H和 IFCF-L菌株）三種被廣泛用于害蟲生物防治的蟲生真菌中篩選對紅火蟻致病力較強且無忌避性的菌株。生物測定結果表明，在侵染

3、后第十天，Bb04、M09、Ma01和IFCF-H菌株對紅火蟻的LC50分別為3.04×106、9.90×105、6.13×106和1.20×107孢子/ml，其中M09菌株的LC50最小，致病力最強，且致死時間較短，LT50為2.7天。而Bb02、SM076和IFCF-L菌株對紅火蟻的致病力較弱，作用時間較長。紅火蟻對菌株孢子懸浮液的覓食反應結果表明，白僵菌Bb04菌株對紅火蟻具有明顯的驅避作用，而其它菌株對紅火蟻的驅避作用不顯著。綜

4、合致病力和驅避性檢測結果，綠僵菌M09對紅火蟻具有較強致病能力和較快的致死效應，且M09菌株對紅火蟻無明顯的驅避作用，故將其作為篩選到的合適的菌株進行以下的實驗。
　　2、M09菌株的分子鑒定以及侵染紅火蟻過程的電鏡觀察
　　利用核糖體DNA（rDNA）內轉錄間隔區(qū)（ITS）序列對M09菌株所屬亞種進行了分子鑒定。序列同源性比對及N-J進化樹構建結果表明，綠僵菌M09菌株屬于金龜子綠僵菌小孢變種（Metarhizium an

5、isopliaevar.anisopliae）。掃描電鏡觀察表明，綠僵菌接種后，分生孢子主要附著在紅火蟻的觸角、脊狀突起區(qū)、節(jié)間膜、剛毛窩、氣孔以及褶皺處等部位，而平滑區(qū)域附著的孢子相對較少。接種后12小時，大部分分生孢子萌發(fā)形成芽管，少數(shù)分生孢子可形成雙芽管。接種24小時后，部分芽管末端膨大形成附著胞，芽管或附著胞在體壁上分泌少量分泌物。最后芽管伸長穿透紅火蟻體壁，進入表皮層及體腔。透射電鏡觀察表明，接種24小時后，侵入紅火蟻表皮的芽

6、管生長并
　　產(chǎn)生顆粒狀菌絲和長絲狀菌絲段，寄主的表皮在菌絲侵染的機械力的作用下開始呈波浪起伏狀。接種36小時后，表皮層中的菌絲開始侵入肌肉組織，伴隨著機械壓力以及分泌活性物質，菌絲段旁邊的肌肉組織出現(xiàn)溶解。接種72小時后，菌絲開始侵入中腸細胞，破壞中腸的消化功能。接種96小時后，綠僵菌菌絲通過分隔的方式在紅火蟻體內大量繁殖，紅火蟻的器官和組織慢慢溶解。
　　3、綠僵菌脅迫對育幼蟻護蛹行為的影響
　　在社會性昆蟲中，幼

7、蟲作為最寶貴的下一代資源，對其種群的發(fā)展和壯大具有舉足輕重的作用。研究結果表明，當蛹被綠僵菌侵染后，工蟻對蛹的育幼行為顯著增加，主要表現(xiàn)為：工蟻對侵染蛹的育幼總時間為對照組的5.3倍，每次照顧幼蟲的平均持續(xù)時間為對照組的5.2倍。而且，育幼行為能顯著減少侵染蛹的體表分生孢子數(shù)量，在無工蟻、2只工蟻和10只工蟻存在條件下，蛹體表平均孢子數(shù)分別為103.1、51.6和31.3個。此外，工蟻的育幼還能抑制蛹體表孢子的萌發(fā)，處理20小時后，無工

8、蟻、2只工蟻和10只工蟻存在條件下，蛹體表孢子萌發(fā)率分別為95.1％、80.4%和59.9%。蛹的羽化率也隨著工蟻數(shù)量增加顯著升高。紅火蟻工蟻通過育幼行為防御病原真菌侵染蛹的策略為種群的延續(xù)和發(fā)展提供了保障。
　　4、綠僵菌脅迫對育幼蟻向覓食蟻行為轉變的影響及轉錄組分析
　　紅火蟻具有根據(jù)年齡調節(jié)工蟻勞動分工行為的能力，即年紀較小的工蟻在巢內從事哺育幼蟻和照顧蟻后的任務，隨著年齡的增大（2-3周），工蟻轉變成為出巢從事覓食和

9、防御等任務的覓食蟻。病原真菌侵染對這種行為轉變有一定的影響，具體表現(xiàn)為育幼蟻被綠僵菌侵染后，在蛹室的活動時間逐漸減少，由第1天的103.4秒降低至第3天的38.5秒；而且育幼時間占蛹室活動時間的比例也降低，由第1天的13.6%降低至第3天的3.5%；幼蟻感病三天后接觸蟻后的次數(shù)也顯著減少。說明育幼蟻在綠僵菌侵染脅迫下會加速從巢內向巢外活動，且行為方式由育幼蟻轉換成覓食蟻。健康育幼蟻、感病育幼蟻和覓食蟻所共有的基因聚類分析表明，雖然育幼蟻

10、感病后其行為會提前向覓食蟻轉變，但整體的基因表達模式并未向覓食蟻轉變。育幼蟻被真菌感染后，有289個基因表達水平發(fā)生顯著變化，其中190個基因顯著上調。GO注釋顯示差異表達基因顯著富集于17條GO term。而育幼蟻-覓食蟻間共有284個顯著差異表達基因，共富集到16條GO term上。通過比較健康-感病育幼蟻和育幼蟻-覓食蟻的RNA-seq，發(fā)現(xiàn)共有43個差異表達基因，包括一些解毒酶基因P450及氣味結合蛋白Gp-9；且有11條通路在

11、兩組中均顯著富集，包括抗氧化活性和離子結合功能基因的富集。兩組間共同差異表達的這43個基因和11個GO通路可能調控育幼蟻感病后的行為，使其向覓食蟻行為轉變。
　　5、綠僵菌脅迫影響覓食蟻的覓食和交哺行為
　　紅火蟻被真菌侵染后第4天取食量明顯比對照增多，為0.78μg/只，而對照為0.62μg/只，表明真菌侵染紅火蟻后耗費了紅火蟻的能量物質，所以紅火蟻需要取食更多以維持體內能量平衡。食物中添加苦味性生物堿（奎寧）對紅火蟻具有

12、明顯的驅避作用，然而當紅火蟻被真菌侵染后第3天開始，紅火蟻對含奎寧的食物耐受性增強，忍耐值（TI）第1、2天分別為-0.12和0.01，而第3天高達0.35。雖然被真菌侵染后，紅火蟻的覓食量增加，但是體內的覓食基因的表達和對照沒有顯著差異（P>0.05）。故紅火蟻的覓食行為變化和覓食基因沒有關聯(lián)。此外，被真菌侵染后第3天，紅火蟻的交哺行為頻率也比對照顯著增加，染菌螞蟻為3.1次/分鐘，而對照為1.4次/分鐘。但是體表的16種表皮碳氫化合

13、物的含量沒有明顯變化，推測感病工蟻不是通過體表的碳氫化合物變化來告知同伴自己的感病狀況。
　　6、綠僵菌脅迫下紅火蟻梳理行為變化
　　紅火蟻的梳理行為對抵御真菌的侵染效果具有重要作用。在不同工蟻密度下，紅火蟻對綠僵菌的抵抗力不同，單頭工蟻時被綠僵菌侵染后的死亡風險比率是群體時的1.8倍。單頭紅火蟻情況下被真菌處理的螞蟻表現(xiàn)出更多的自我梳理行為，梳理行為的總時間和每次持續(xù)時間分別為47.2和15.1秒，而對照分別為6.5和2.

14、4秒。群體條件下，同伴對被綠僵菌侵染的螞蟻表現(xiàn)更多的相互梳理行為，對真菌侵染螞蟻的相互梳理行為的總時間和每次持續(xù)的時間分別為39.2和14.84秒，而對對照螞蟻分別為21.6和5.5秒。群體條件下螞蟻體表更多的孢子被移除，單頭螞蟻情況下自我梳理行為僅能移除體表21.9%的孢子，而群體條件下能移除體表77.3%的孢子，說明相互梳理行為比自我梳理行為的清潔作用更強。紅火蟻同伴之間的梳理行為增加了健康同伴接觸病原真菌的機會，可能導致同伴也被真

15、菌感染，之前未接觸感病同伴的紅火蟻，死亡風險比率是之前接觸感病同伴螞蟻的1.52倍。說明接觸到少量的病原真菌的同伴不僅不會導致死亡率明顯上升，反而在短期內能夠有效提高其對病原真菌的免疫能力，間接證明紅火蟻中存在社會免疫現(xiàn)象。
　　7、綠僵菌脅迫加快紅火蟻的搬尸行為
　　同巢和異巢螞蟻的尸體誘導紅火蟻的搬尸行為的時間不同，同巢同伴尸體平均需要495秒才能誘導紅火蟻的搬尸行為，而異巢螞蟻尸體只需305秒；紅火蟻螞蟻對異巣死亡1小

16、時內的螞蟻尸體的攻擊反應更強。紅火蟻對同巢中不同發(fā)育階段（成蟲和蛹）的同伴尸體表現(xiàn)的搬尸行為不同，紅火蟻在1小時內就將幾乎所有的工蟻尸體丟至棄尸堆，而對蛹尸體，則需24-48小時才能識別尸體并將其丟至棄尸堆。紅火蟻死亡1小時內即能誘發(fā)同伴的搬尸行為，說明同伴能夠快速識別成蟲的尸體；但是未檢測到成蟲死亡1小時后體表化學物質變化。蛹死亡24小時后，被綠僵菌侵染的蛹尸體體表脂肪酸含量明顯高于對照，染菌尸體體表棕櫚酸、亞油酸和油酸含量分別為0.

17、62、0.7和1.1μg/只，而對照分別為0.38、0.27和0.42μg/只。將三種脂肪酸純品滴加在剛死亡的蛹體表時，能顯著增加蛹尸體被丟至棄尸堆的比例，滴加棕櫚酸、亞油酸和油酸的蛹尸體被搬運到棄尸堆的比例分別為11.1%、50.5%和68.9%。說明三種脂肪酸均能誘發(fā)紅火蟻對蛹的搬尸行為，其中油酸誘發(fā)紅火蟻搬尸行為的效果最強。被綠僵菌侵染的蛹尸體體表脂肪酸的快速積累誘導紅火蟻的搬尸行為有利于降低其它蛹、幼蟻或蟻后被真菌侵染的風險，降

18、低真菌在蟻巢內流行的可能性。
　　結論：在病原真菌脅迫下，不同品級的紅火蟻工蟻會通過社會行為以抑制病原真菌在蟻巣內傳播。當幼蟲被真菌感染后，育幼蟻會表現(xiàn)更頻繁的育幼行為以減少孢子的附著及萌發(fā)，增加幼蟲的存活的機會；而當育幼蟻自身被感染真菌后則會減少和巣內的幼蟲及蟻后接觸，避免將真菌傳染給巣內重要的個體。覓食蟻被感染后，會增加覓食和交哺行為；并改變其對食物的偏好性，對原來拒絕取食的奎寧類生物堿變?yōu)橹鲃尤∈?，從而增強了其對真菌侵染的?/p>