綠僵菌脅迫下紅火蟻的防御行為及機(jī)制探討.pdf

1、社會(huì)性昆蟲(chóng)營(yíng)群居生活的特性，巢內(nèi)頻繁的個(gè)體接觸、溫暖及高濕的生境極其有利于病原菌在巣內(nèi)傳播。然而在漫長(zhǎng)的自然進(jìn)化過(guò)程中，在病原菌對(duì)社會(huì)性昆蟲(chóng)的巨大的自然選擇壓力下，社會(huì)性昆蟲(chóng)進(jìn)化出了復(fù)雜的社會(huì)行為以防御病原菌在巣內(nèi)傳播，這種進(jìn)化上的優(yōu)勢(shì)為利用蟲(chóng)生真菌防治社會(huì)昆蟲(chóng)提出了巨大的挑戰(zhàn)。紅火蟻（Solenopsis invicta）屬于膜翅目蟻科，是一種重大入侵性社會(huì)昆蟲(chóng)。為了有效利用蟲(chóng)生真菌防治紅火蟻，有必要深入研究紅火蟻防御病原真菌的行為及

2、其機(jī)制，為針對(duì)性地設(shè)計(jì)蟲(chóng)生真菌制劑及施用方式提供理論基礎(chǔ)。因此，本論文針對(duì)紅火蟻巣內(nèi)不同分工的工蟻在病原真菌脅迫下的行為反應(yīng)及其內(nèi)在機(jī)制展開(kāi)了研究，主要結(jié)果分述如下：
　　1、蟲(chóng)生真菌菌株篩選
　　從白僵菌（Bb02和Bb04菌株）、綠僵菌（Ma01、SM076和M09菌株）和玫煙色棒束孢（IFCF-H和 IFCF-L菌株）三種被廣泛用于害蟲(chóng)生物防治的蟲(chóng)生真菌中篩選對(duì)紅火蟻致病力較強(qiáng)且無(wú)忌避性的菌株。生物測(cè)定結(jié)果表明，在侵染

3、后第十天，Bb04、M09、Ma01和IFCF-H菌株對(duì)紅火蟻的LC50分別為3.04×106、9.90×105、6.13×106和1.20×107孢子/ml，其中M09菌株的LC50最小，致病力最強(qiáng)，且致死時(shí)間較短，LT50為2.7天。而B(niǎo)b02、SM076和IFCF-L菌株對(duì)紅火蟻的致病力較弱，作用時(shí)間較長(zhǎng)。紅火蟻對(duì)菌株孢子懸浮液的覓食反應(yīng)結(jié)果表明，白僵菌Bb04菌株對(duì)紅火蟻具有明顯的驅(qū)避作用，而其它菌株對(duì)紅火蟻的驅(qū)避作用不顯著。綜

4、合致病力和驅(qū)避性檢測(cè)結(jié)果，綠僵菌M09對(duì)紅火蟻具有較強(qiáng)致病能力和較快的致死效應(yīng)，且M09菌株對(duì)紅火蟻無(wú)明顯的驅(qū)避作用，故將其作為篩選到的合適的菌株進(jìn)行以下的實(shí)驗(yàn)。
　　2、M09菌株的分子鑒定以及侵染紅火蟻過(guò)程的電鏡觀察
　　利用核糖體DNA（rDNA）內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）序列對(duì)M09菌株所屬亞種進(jìn)行了分子鑒定。序列同源性比對(duì)及N-J進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建結(jié)果表明，綠僵菌M09菌株屬于金龜子綠僵菌小孢變種（Metarhizium an

5、isopliaevar.anisopliae）。掃描電鏡觀察表明，綠僵菌接種后，分生孢子主要附著在紅火蟻的觸角、脊?fàn)钔黄饏^(qū)、節(jié)間膜、剛毛窩、氣孔以及褶皺處等部位，而平滑區(qū)域附著的孢子相對(duì)較少。接種后12小時(shí)，大部分分生孢子萌發(fā)形成芽管，少數(shù)分生孢子可形成雙芽管。接種24小時(shí)后，部分芽管末端膨大形成附著胞，芽管或附著胞在體壁上分泌少量分泌物。最后芽管伸長(zhǎng)穿透紅火蟻體壁，進(jìn)入表皮層及體腔。透射電鏡觀察表明，接種24小時(shí)后，侵入紅火蟻表皮的芽

6、管生長(zhǎng)并
　　產(chǎn)生顆粒狀菌絲和長(zhǎng)絲狀菌絲段，寄主的表皮在菌絲侵染的機(jī)械力的作用下開(kāi)始呈波浪起伏狀。接種36小時(shí)后，表皮層中的菌絲開(kāi)始侵入肌肉組織，伴隨著機(jī)械壓力以及分泌活性物質(zhì)，菌絲段旁邊的肌肉組織出現(xiàn)溶解。接種72小時(shí)后，菌絲開(kāi)始侵入中腸細(xì)胞，破壞中腸的消化功能。接種96小時(shí)后，綠僵菌菌絲通過(guò)分隔的方式在紅火蟻體內(nèi)大量繁殖，紅火蟻的器官和組織慢慢溶解。
　　3、綠僵菌脅迫對(duì)育幼蟻?zhàn)o(hù)蛹行為的影響
　　在社會(huì)性昆蟲(chóng)中，幼

7、蟲(chóng)作為最寶貴的下一代資源，對(duì)其種群的發(fā)展和壯大具有舉足輕重的作用。研究結(jié)果表明，當(dāng)蛹被綠僵菌侵染后，工蟻對(duì)蛹的育幼行為顯著增加，主要表現(xiàn)為：工蟻對(duì)侵染蛹的育幼總時(shí)間為對(duì)照組的5.3倍，每次照顧幼蟲(chóng)的平均持續(xù)時(shí)間為對(duì)照組的5.2倍。而且，育幼行為能顯著減少侵染蛹的體表分生孢子數(shù)量，在無(wú)工蟻、2只工蟻和10只工蟻存在條件下，蛹體表平均孢子數(shù)分別為103.1、51.6和31.3個(gè)。此外，工蟻的育幼還能抑制蛹體表孢子的萌發(fā)，處理20小時(shí)后，無(wú)工

8、蟻、2只工蟻和10只工蟻存在條件下，蛹體表孢子萌發(fā)率分別為95.1％、80.4%和59.9%。蛹的羽化率也隨著工蟻數(shù)量增加顯著升高。紅火蟻工蟻通過(guò)育幼行為防御病原真菌侵染蛹的策略為種群的延續(xù)和發(fā)展提供了保障。
　　4、綠僵菌脅迫對(duì)育幼蟻向覓食蟻行為轉(zhuǎn)變的影響及轉(zhuǎn)錄組分析
　　紅火蟻具有根據(jù)年齡調(diào)節(jié)工蟻勞動(dòng)分工行為的能力，即年紀(jì)較小的工蟻在巢內(nèi)從事哺育幼蟻和照顧蟻后的任務(wù)，隨著年齡的增大（2-3周），工蟻轉(zhuǎn)變成為出巢從事覓食和

9、防御等任務(wù)的覓食蟻。病原真菌侵染對(duì)這種行為轉(zhuǎn)變有一定的影響，具體表現(xiàn)為育幼蟻被綠僵菌侵染后，在蛹室的活動(dòng)時(shí)間逐漸減少，由第1天的103.4秒降低至第3天的38.5秒；而且育幼時(shí)間占蛹室活動(dòng)時(shí)間的比例也降低，由第1天的13.6%降低至第3天的3.5%；幼蟻感病三天后接觸蟻后的次數(shù)也顯著減少。說(shuō)明育幼蟻在綠僵菌侵染脅迫下會(huì)加速?gòu)某矁?nèi)向巢外活動(dòng)，且行為方式由育幼蟻轉(zhuǎn)換成覓食蟻。健康育幼蟻、感病育幼蟻和覓食蟻所共有的基因聚類分析表明，雖然育幼蟻

10、感病后其行為會(huì)提前向覓食蟻轉(zhuǎn)變，但整體的基因表達(dá)模式并未向覓食蟻轉(zhuǎn)變。育幼蟻被真菌感染后，有289個(gè)基因表達(dá)水平發(fā)生顯著變化，其中190個(gè)基因顯著上調(diào)。GO注釋顯示差異表達(dá)基因顯著富集于17條GO term。而育幼蟻-覓食蟻間共有284個(gè)顯著差異表達(dá)基因，共富集到16條GO term上。通過(guò)比較健康-感病育幼蟻和育幼蟻-覓食蟻的RNA-seq，發(fā)現(xiàn)共有43個(gè)差異表達(dá)基因，包括一些解毒酶基因P450及氣味結(jié)合蛋白Gp-9；且有11條通路在

11、兩組中均顯著富集，包括抗氧化活性和離子結(jié)合功能基因的富集。兩組間共同差異表達(dá)的這43個(gè)基因和11個(gè)GO通路可能調(diào)控育幼蟻感病后的行為，使其向覓食蟻行為轉(zhuǎn)變。
　　5、綠僵菌脅迫影響覓食蟻的覓食和交哺行為
　　紅火蟻被真菌侵染后第4天取食量明顯比對(duì)照增多，為0.78μg/只，而對(duì)照為0.62μg/只，表明真菌侵染紅火蟻后耗費(fèi)了紅火蟻的能量物質(zhì)，所以紅火蟻需要取食更多以維持體內(nèi)能量平衡。食物中添加苦味性生物堿（奎寧）對(duì)紅火蟻具有

12、明顯的驅(qū)避作用，然而當(dāng)紅火蟻被真菌侵染后第3天開(kāi)始，紅火蟻對(duì)含奎寧的食物耐受性增強(qiáng)，忍耐值（TI）第1、2天分別為-0.12和0.01，而第3天高達(dá)0.35。雖然被真菌侵染后，紅火蟻的覓食量增加，但是體內(nèi)的覓食基因的表達(dá)和對(duì)照沒(méi)有顯著差異（P>0.05）。故紅火蟻的覓食行為變化和覓食基因沒(méi)有關(guān)聯(lián)。此外，被真菌侵染后第3天，紅火蟻的交哺行為頻率也比對(duì)照顯著增加，染菌螞蟻為3.1次/分鐘，而對(duì)照為1.4次/分鐘。但是體表的16種表皮碳?xì)浠?/p>

13、物的含量沒(méi)有明顯變化，推測(cè)感病工蟻不是通過(guò)體表的碳?xì)浠衔镒兓瘉?lái)告知同伴自己的感病狀況。
　　6、綠僵菌脅迫下紅火蟻梳理行為變化
　　紅火蟻的梳理行為對(duì)抵御真菌的侵染效果具有重要作用。在不同工蟻密度下，紅火蟻對(duì)綠僵菌的抵抗力不同，單頭工蟻時(shí)被綠僵菌侵染后的死亡風(fēng)險(xiǎn)比率是群體時(shí)的1.8倍。單頭紅火蟻情況下被真菌處理的螞蟻表現(xiàn)出更多的自我梳理行為，梳理行為的總時(shí)間和每次持續(xù)時(shí)間分別為47.2和15.1秒，而對(duì)照分別為6.5和2.

14、4秒。群體條件下，同伴對(duì)被綠僵菌侵染的螞蟻表現(xiàn)更多的相互梳理行為，對(duì)真菌侵染螞蟻的相互梳理行為的總時(shí)間和每次持續(xù)的時(shí)間分別為39.2和14.84秒，而對(duì)對(duì)照螞蟻分別為21.6和5.5秒。群體條件下螞蟻體表更多的孢子被移除，單頭螞蟻情況下自我梳理行為僅能移除體表21.9%的孢子，而群體條件下能移除體表77.3%的孢子，說(shuō)明相互梳理行為比自我梳理行為的清潔作用更強(qiáng)。紅火蟻同伴之間的梳理行為增加了健康同伴接觸病原真菌的機(jī)會(huì)，可能導(dǎo)致同伴也被真

15、菌感染，之前未接觸感病同伴的紅火蟻，死亡風(fēng)險(xiǎn)比率是之前接觸感病同伴螞蟻的1.52倍。說(shuō)明接觸到少量的病原真菌的同伴不僅不會(huì)導(dǎo)致死亡率明顯上升，反而在短期內(nèi)能夠有效提高其對(duì)病原真菌的免疫能力，間接證明紅火蟻中存在社會(huì)免疫現(xiàn)象。
　　7、綠僵菌脅迫加快紅火蟻的搬尸行為
　　同巢和異巢螞蟻的尸體誘導(dǎo)紅火蟻的搬尸行為的時(shí)間不同，同巢同伴尸體平均需要495秒才能誘導(dǎo)紅火蟻的搬尸行為，而異巢螞蟻尸體只需305秒；紅火蟻螞蟻對(duì)異巣死亡1小

16、時(shí)內(nèi)的螞蟻尸體的攻擊反應(yīng)更強(qiáng)。紅火蟻對(duì)同巢中不同發(fā)育階段（成蟲(chóng)和蛹）的同伴尸體表現(xiàn)的搬尸行為不同，紅火蟻在1小時(shí)內(nèi)就將幾乎所有的工蟻尸體丟至棄尸堆，而對(duì)蛹尸體，則需24-48小時(shí)才能識(shí)別尸體并將其丟至棄尸堆。紅火蟻死亡1小時(shí)內(nèi)即能誘發(fā)同伴的搬尸行為，說(shuō)明同伴能夠快速識(shí)別成蟲(chóng)的尸體；但是未檢測(cè)到成蟲(chóng)死亡1小時(shí)后體表化學(xué)物質(zhì)變化。蛹死亡24小時(shí)后，被綠僵菌侵染的蛹尸體體表脂肪酸含量明顯高于對(duì)照，染菌尸體體表棕櫚酸、亞油酸和油酸含量分別為0.

17、62、0.7和1.1μg/只，而對(duì)照分別為0.38、0.27和0.42μg/只。將三種脂肪酸純品滴加在剛死亡的蛹體表時(shí)，能顯著增加蛹尸體被丟至棄尸堆的比例，滴加棕櫚酸、亞油酸和油酸的蛹尸體被搬運(yùn)到棄尸堆的比例分別為11.1%、50.5%和68.9%。說(shuō)明三種脂肪酸均能誘發(fā)紅火蟻對(duì)蛹的搬尸行為，其中油酸誘發(fā)紅火蟻搬尸行為的效果最強(qiáng)。被綠僵菌侵染的蛹尸體體表脂肪酸的快速積累誘導(dǎo)紅火蟻的搬尸行為有利于降低其它蛹、幼蟻或蟻后被真菌侵染的風(fēng)險(xiǎn)，降

18、低真菌在蟻巢內(nèi)流行的可能性。
　　結(jié)論：在病原真菌脅迫下，不同品級(jí)的紅火蟻工蟻會(huì)通過(guò)社會(huì)行為以抑制病原真菌在蟻巣內(nèi)傳播。當(dāng)幼蟲(chóng)被真菌感染后，育幼蟻會(huì)表現(xiàn)更頻繁的育幼行為以減少孢子的附著及萌發(fā)，增加幼蟲(chóng)的存活的機(jī)會(huì)；而當(dāng)育幼蟻?zhàn)陨肀桓腥菊婢髣t會(huì)減少和巣內(nèi)的幼蟲(chóng)及蟻后接觸，避免將真菌傳染給巣內(nèi)重要的個(gè)體。覓食蟻被感染后，會(huì)增加覓食和交哺行為；并改變其對(duì)食物的偏好性，對(duì)原來(lái)拒絕取食的奎寧類生物堿變?yōu)橹鲃?dòng)取食，從而增強(qiáng)了其對(duì)真菌侵染的抵