川西獐芽菜體細(xì)胞雜交及其環(huán)烯醚萜類(lèi)化合物合成相關(guān)基因香葉醇-10羥化酶的克隆和功能驗(yàn)證.pdf

1、中藥材有效成分的絕大多數(shù)都來(lái)源于次生代謝產(chǎn)物，利用細(xì)胞工程(體細(xì)胞雜交)及次生代謝的基因工程，來(lái)改良中藥材品質(zhì)的研究具有重要意義。
　　 體細(xì)胞雜交可轉(zhuǎn)移并提高藥效成分含量，實(shí)現(xiàn)藥用成分合成基因在不同科、屬、種間的相互轉(zhuǎn)移，獲得含有高含量異源藥效成分的體細(xì)胞雜種。目前有關(guān)中藥材體細(xì)胞雜交研究已有一些成功的例證，其中狹葉柴胡與川西獐牙菜體細(xì)胞雜交已獲得雜種植株(向鳳寧等，2003)，但是雜種中異源染色體/DNA的存在方式、異源有效

2、成分合成相關(guān)基因表達(dá)與異源有效成分積累的相關(guān)性尚未進(jìn)行深入分析。
　　 次生代謝產(chǎn)物關(guān)鍵酶基因的克隆及轉(zhuǎn)化是植物次生代謝工程的研究熱點(diǎn)。通過(guò)超量表達(dá)相關(guān)限速酶基因，來(lái)提高目標(biāo)代謝物產(chǎn)量是植物代謝工程的主要策略之一。目前在基因水平上萜類(lèi)合成途徑研究較為清楚，單萜類(lèi)代謝途徑中的一些基因已被克隆，但有關(guān)中藥材有效成分合成相關(guān)基因的發(fā)掘才剛剛開(kāi)始。
　　 高寒藏藥材--川西獐牙菜(Swertia mussotii Franch)

3、專(zhuān)治黃膽性肝炎及病毒性肝炎，野生資源匱乏。其主要有效成分為芒果苷、獐牙菜苦苷和龍膽苦苷。
　　 獐牙菜苦苷(swertiamarin)和龍膽苦苷(gentiopicroside)屬于環(huán)烯醚萜類(lèi)(iridoid)化合物，它們的生物合成途徑尚未完全已知。香葉醇(geraniol)是環(huán)烯醚萜類(lèi)化合物(iridoid)生物合成途徑的重要組分，它的氧化被認(rèn)為是烯醚萜類(lèi)化合物合成途徑中第一個(gè)限速步驟，此反應(yīng)由香葉醇-10羥化酶(gerani

4、ol10-hydroxylase，G10H)催化香葉醇而生成10羥基-香葉醇(10-hydroxygeraniol)。
　　 本論文開(kāi)展了狹葉柴胡與川西獐牙菜體細(xì)胞雜交研究，獲得了體細(xì)胞雜種再生植株；分析了不同雜種中的藥效成分含量；比較了川西獐牙菜(供體)染色體、核基因組DNA及SmG10H基因在不同雜種細(xì)胞系中的差異；初步確定了雜種中供體核基因組組成及SmG10H基因表達(dá)模式與異源藥效成分含量的關(guān)系。探討了UV劑量對(duì)雜種生長(zhǎng)、

5、染色體消減和片段化的影響。
　　 通過(guò)狹葉柴胡與川西獐牙菜體細(xì)胞雜種及雙親細(xì)胞色素P450(cytochrome P450)基因片段序列分析，發(fā)現(xiàn)了雜種中存在一個(gè)與川西獐牙菜香葉醇-10羥化酶(G10H)基因同源的片段。在此基礎(chǔ)上，首次分離了川西獐牙菜的香葉醇-10羥化酶的全長(zhǎng)新基因(SmG10H)；分析了在誘導(dǎo)子茉莉酸甲酯(MeJA)處理下，環(huán)烯醚萜類(lèi)化合物代謝途徑中相關(guān)酶基因表達(dá)水平的差異及其與藥效成分積累的關(guān)系。完成了Sm

6、G10H在原核大腸桿菌、真核酵母中的功能驗(yàn)證及酶活力測(cè)定；實(shí)現(xiàn)了SmG10H對(duì)川西獐牙菜胚性愈傷組織的轉(zhuǎn)化，獲得了獐牙菜苦苷和龍膽苦苷含量高的轉(zhuǎn)基因植株，為進(jìn)一步研究轉(zhuǎn)基因植株及后代環(huán)烯醚萜類(lèi)化合物代謝的分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。
　　 主要研究過(guò)程及實(shí)驗(yàn)結(jié)果包括：
　　 1.狹葉柴胡與川西獐牙菜體細(xì)胞雜交
　　 1.1體細(xì)胞雜種細(xì)胞系及其再生植株的獲得
　　 以高寒藏藥材川西獐牙菜原生質(zhì)體為供體，經(jīng)380μW

7、/c㎡的紫外線照射0 sec、30 sec、1 min、2 min和3 min后，與狹葉柴胡原生質(zhì)體(受體)在PEG誘導(dǎo)下進(jìn)行融合，共產(chǎn)生194塊愈傷組織，其中，3個(gè)克隆再生出完整綠苗，并移栽成活。經(jīng)染色體和同工酶分析，證明了104個(gè)細(xì)胞系的雜種性質(zhì)。
　　 1.2體細(xì)胞雜種核基因組組成分析
　　 1.2.1雜種染色體和GISH分析
　　 雙親染色體數(shù)目：狹葉柴胡愈傷組織染色體數(shù)目為11-12條，川西獐牙菜愈傷組

8、織染色體數(shù)目為17-20條，雜種染色體數(shù)目為11-20條。
　　 GISH結(jié)果顯示：雜種細(xì)胞系B24(具有分化能力，可再生植株)和C10(無(wú)分化能力)中狹葉柴胡染色體均為11-13，完整川西獐牙菜染色體及其染色體小片段數(shù)目分別為：0-3/1-3和0-1/5-9。表明，隨UV-射線劑量的增加，完整川西獐牙菜染色體數(shù)目逐漸減少，供體染色體小片段數(shù)目增加，證明了UV劑量在雜種川西獐牙菜染色體消減及片段化中的作用。
　　 1.2

9、.2 RAPD分析
　　 200個(gè)隨機(jī)引物的PCR擴(kuò)增分析表明：1)雜種細(xì)胞系均含有雙親特征譜帶或新帶；2)雜種中保留了91.2％-96.0％的狹葉柴胡DNA譜帶、0.2％-2.6％的川西獐牙菜供體DNA譜帶。表明體細(xì)胞雜種的核基因組以受體狹葉柴胡為主，受體對(duì)雜種的核基因組貢獻(xiàn)大于供體；3)除C10外，不同雜種的供體帶比例及新帶比例差別較小，表明雜種中供體DNA組成相近；4)雜種中供體DNA和重組DNA含量與紫外照射的時(shí)間成正相

10、關(guān)。
　　 1.3體細(xì)胞雜種中藥效成分含量及醇溶性成分的代謝譜變化分析
　　 HPLC測(cè)定發(fā)現(xiàn)，所有的74個(gè)雜種細(xì)胞系中均不含有龍膽苦苷，雜種B24、B27、B132、C18、C26、C47和C124含有獐牙菜苦苷(含量為0.0074-0.0812 mg/g)，雜種克隆B6、B40、B56、C10和C121僅含芒果苷(含量為0.0863-0.8168 mg/g)，其中，B6、B56和C10含量高于親本川西獐牙菜(0.66

11、4.1 mg/g)，表明，供體川西獐牙菜的獐牙菜苦苷和芒果苷已轉(zhuǎn)入受體狹葉柴胡中。GC-MS分析表明，雜種中含有大部分柴胡(受體)的特征性物質(zhì)，少量的川西獐牙菜特征性物質(zhì)及非雙親物質(zhì)(新物質(zhì))。
　　 1.4細(xì)胞色素P450基因在雜種及雙親中的存在方式
　　 利用CYP76的簡(jiǎn)并引物對(duì)川西獐牙菜、狹葉柴胡及其體細(xì)胞雜種細(xì)胞系A(chǔ)6、A67、B24、B27、B132、C18、C26、C47和C124進(jìn)行了RT-PCR擴(kuò)增，獲

12、得了11個(gè)長(zhǎng)度約1100-1200bp的G10H基因的同源片段。基因片段序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，狹葉柴胡的G10H與川西獐牙菜的同源性為45.7％；雜種B24、B27、B132、C18、C26、C47和C124的G10H與川西獐牙菜(SmG10H)的完全相同，表明它們可能來(lái)源于供體川西獐牙菜。雜種A6、A67的G10H與狹葉柴胡的同源性(84.1％)遠(yuǎn)高于與川西獐牙菜的同源性(53.1％)，表明，該基因片段可能來(lái)源于狹葉柴胡。研究表明，G10H除

13、了參與吲哚生物堿的合成，亦可能參與了環(huán)烯醚萜類(lèi)代謝合成，而抗肝炎藥效成分獐牙菜苦苷及龍膽苦苷均為此類(lèi)物質(zhì)，因此，該基因亦可能參與了它們的合成，有必要作為本實(shí)驗(yàn)中的目標(biāo)基因進(jìn)行深入研究。
　　 1.5 SmG10H在體細(xì)胞雜種中的表達(dá)及其與獐牙菜苦苷含量的關(guān)系
　　 半定量RT-PCR分析表明，SmG10H表達(dá)水平：雜種B24、B132、C47低于親本川西獐牙菜；B24和B132接近，但高于C47；A6未見(jiàn)表達(dá)。表明，不同

14、雜種SmG10H的表達(dá)水平存在明顯差異。HPLC分析表明，雜種中獐牙菜苦苷含量(0.0074-0.0812 mg/g)低于親本川西獐牙菜(0.9298 mg/g)，其中B24和B132高于C47；A6未檢測(cè)出獐牙菜苦苷。表明，A6的SmG10H未表達(dá)，其不含獐牙菜苦苷；B24、B132表達(dá)水平較高，其獐牙菜苦苷含量亦較高；C47的表達(dá)水平低，其含量亦低。由此而知，雜種SmG10H表達(dá)與獐牙菜苦苷含量呈正相關(guān)。總之，含有獐牙菜苦苷體細(xì)胞雜

15、種中存在可能來(lái)源于供體川西獐牙菜SmG10H，該基因的表達(dá)量與雜種獐牙菜苦苷成正相關(guān)。
　　 2.川西獐牙菜環(huán)烯醚萜類(lèi)化合物相關(guān)基因的克隆和功能驗(yàn)證
　　 2.1香葉醇10-羥化酶(SmG10H)基因的克隆
　　 采用RACE-PCR技術(shù)，從川西獐牙菜中分離了1個(gè)香葉醇10-羥化酶基因的全長(zhǎng)cDNA，命名為：SmG10H(CYP76810，Genbank號(hào)為GU168041)。序列分析表明，它們的ORF核苷酸長(zhǎng)度

16、為1488 bp，編碼496個(gè)氨基酸，蛋白質(zhì)分子量均為55.5 kDa。該基因全長(zhǎng)為1637 bp，在882-1030 bp位置有一個(gè)大小為149 bp的內(nèi)含子。系統(tǒng)樹(shù)分析表明，該基因氨基酸序列在進(jìn)化上與長(zhǎng)春花的CYP7686具有高的同源性(80.2％)。
　　 2.2 SmG10H在川西獐牙菜基因組中的分布Southern blot分析表明，SmG10H在川西獐牙菜基因組中以單拷貝的形式存在。
　　 2.3環(huán)烯醚萜類(lèi)化

17、合物代謝途徑中相關(guān)基因的表達(dá)分析
　　 2.3.1 SmG10H在川西獐牙菜中的表達(dá)分析
　　 半定量RT-PCR和Real-time PCR分析表明，SmG10H在川西獐牙菜葉片中高表達(dá)，在根和莖中的表達(dá)量甚微。SmG10H在葉中的表達(dá)量是根中的24.9倍，莖中的10.2倍。
　　 2.3.2 MeJA對(duì)環(huán)烯醚萜類(lèi)化合物合成相關(guān)基因表達(dá)及藥效成分含量的影響
　　 克隆環(huán)烯醚萜類(lèi)化合物合成途徑相關(guān)的6個(gè)基

18、因片段：SmG10H、DXS、HMGR、IPP-iso和MECS基因，設(shè)計(jì)特異性引物，分析MeJA處理下，上述基因的表達(dá)變化。
　　 1)不同濃度MeJA誘導(dǎo)的SmG10H表達(dá)選用0、10、20、50、100和150μM的MeJA處理川西獐牙菜再生植株，取處理6h的材料進(jìn)行半定量RT-PCR分析，結(jié)果表明，在50μM下SmG10H表達(dá)量高，為適宜的處理濃度。MeJA處理可顯著提高SmG10H表達(dá)。
　　 2)不同時(shí)間Me

19、JA誘導(dǎo)的目標(biāo)基因表達(dá)模式選用50μM的MeJA處理川西獐牙菜，分別取0 h、6 h、12 h、24 h、36 h的再生植株進(jìn)行半定量RT-PCR和Real-time PCR分析，結(jié)果表明，再生植株在MeJA處理6 h，SmG10H、DXS、HMGR、IPP-iso和MECS基因表達(dá)開(kāi)始上調(diào)，在24小時(shí)時(shí)表達(dá)量最高，然后呈現(xiàn)下降趨勢(shì)；在MeJA處理24 h后，IPP-iso、MECS表達(dá)最強(qiáng)，然后呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。
　　 3)MeJ

20、處理川西獐牙菜對(duì)藥效成分含量的影響川西獐牙菜再生植株在50uM MeJA處理不同時(shí)間下的HPLC分析表明，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，獐牙菜苦苷、龍膽苦苷及芒果苷的含量均持續(xù)增加，在24 h-36 h間其增長(zhǎng)率最高，而到15 d時(shí)含量達(dá)到最高，分別為2.62 mg/g，0.67 mg/g和0.2l mg/g，比對(duì)照(未處理)分別增加了2.5倍，2.2倍和2.7倍。表明，MeJA能夠顯著提高川西獐牙菜抗肝炎藥效成分含量。
　　 4)MeJ

21、A處理下SmG10H表達(dá)與環(huán)烯醚萜類(lèi)化合物含量的關(guān)系MeJA處理12 h后，SmG10H表達(dá)水平高，獐牙菜苦苷和龍膽苦苷含量亦增加，表明，SmG10H表達(dá)水平與環(huán)烯醚萜類(lèi)化合物含量呈正相關(guān)。
　　 2.4 SmG10H基因的功能鑒定
　　 2.4.1 SmG10H在原核細(xì)胞大腸桿菌的表達(dá)驗(yàn)證
　　 1)表達(dá)產(chǎn)物的蛋白特性分析構(gòu)建了帶有SmG10H的大腸桿菌表達(dá)載體pET28a-SmG10H，轉(zhuǎn)化到表達(dá)型菌株BL2

22、1中，陽(yáng)性克隆經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，提取蛋白進(jìn)行SDS-PAGE分析，均獲得了分子量大小為60 kDa的SmG10H譜帶。對(duì)帶有His標(biāo)簽的SmG10H進(jìn)行純化和等電聚焦實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)該蛋白等電點(diǎn)為8.63±0.3。
　　 2)表達(dá)產(chǎn)物的LC-MS分析對(duì)純化的SmG10H蛋白在體外加入底物香葉醇后進(jìn)行液相-質(zhì)譜法(LC-MS)分析，發(fā)現(xiàn)催化反應(yīng)的目標(biāo)產(chǎn)物同10-hydroxygeraniol標(biāo)準(zhǔn)品均在8.3 min處存在一個(gè)峰，質(zhì)譜分析證

23、實(shí)該峰為10羥基香葉醇。從而表明，SmG10H在體外具有催化底物香葉醇生成10羥基香葉醇的活性。
　　 3)酶活力測(cè)定為了進(jìn)一步測(cè)定酶活力大小，對(duì)純化蛋白體外反應(yīng)的催化條件進(jìn)行了優(yōu)化，確定其最佳催化條件為：pH7.7±0.1，溫度為30℃。在此條件下，測(cè)得該蛋白的酶活力大小為0.36±0.02(pkat/mg protein)。
　　 2.4.2 SmG10H在真核細(xì)胞酵母的功能驗(yàn)證
　　 1)SmG10H在酵母

24、的表達(dá)驗(yàn)證構(gòu)建了酵母表達(dá)載體pPICZa-SmG10H，轉(zhuǎn)入畢赤酵母GS115中，SDS-PAGE分析發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因酵母菌與對(duì)照相比均含有SmG10H合成酶譜帶，分子量大小為60.0 kDa。分離轉(zhuǎn)SmG10H酵母的膜蛋白，加入底物香葉醇，通過(guò)LC-MS分析發(fā)現(xiàn)，該膜蛋白的催化產(chǎn)物同10羥基香葉醇標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間均為8.3 min，且質(zhì)譜峰型一致。證明SmG10H能夠表達(dá)，其產(chǎn)物具有酶活性，可在酵母中直接催化底物香葉醇生成10羥基香葉醇，

25、而未轉(zhuǎn)基因酵母未檢測(cè)出10羥基香葉醇。
　　 2)SmG10H酶催化特性在體外催化反應(yīng)中，加入100μgSmG10H蛋白，反應(yīng)時(shí)間為30 min時(shí)，催化反應(yīng)的目標(biāo)產(chǎn)物成線性。以此為最佳反應(yīng)條件，對(duì)轉(zhuǎn)基因酵母SmG10H蛋白進(jìn)行體外酶催化活性分析，測(cè)得該酶的Km=5.2±0.2μM。
　　 2.4.3 SmG10H在植物中的功能驗(yàn)證
　　 1)川西獐牙菜胚性愈傷組織的基因轉(zhuǎn)化利用基因槍法，將過(guò)表達(dá)載體pBGWF7-

26、SmG10H和RNAi載體pK7GWIWG-SmG10H分別轉(zhuǎn)入培養(yǎng)7 d的川西獐牙菜胚性愈傷組織(分化頻率高，達(dá)90％以上)，暗培養(yǎng)24 h，在高濃度(100 mg/L)Kan下篩選出抗性愈傷組織?？剐杂鷤M織在IB分化培養(yǎng)基上分化成苗后，用25 mg/L Kan進(jìn)一步篩選再生植株，獲得了24株抗性植株(SmG10H的過(guò)表達(dá)系15株、RNAi系9株)?？剐灾仓昕侱NA用35S啟動(dòng)子、ccdB及SmG10H5引物進(jìn)行PCR檢測(cè)，鑒定出過(guò)

27、表達(dá)植株3株、RNAi植株3株。SmG10H的過(guò)表達(dá)和RNAi植株轉(zhuǎn)化頻率分別為1.6％和2.0％。半定量RT-PCR分析表明，過(guò)表達(dá)系中SmG10H表達(dá)高于對(duì)照，而在RNAi系中SmG10H的表達(dá)均顯著低于對(duì)照。
　　 2)轉(zhuǎn)基因植株中10-羥基香葉醇及環(huán)烯醚萜類(lèi)含量分析HPLC測(cè)定表明，10-羥基香葉醇、獐牙菜苦苷和龍膽苦苷齊含量在SmG10H過(guò)表達(dá)植株(OS1、OS2、OS3)高于對(duì)照植株，而在RNAi植株(R1、R2、R