龍眼葉片黃酮類化合物合成關(guān)鍵酶基因和DHAR基因cDNA全長的克隆.pdf

1、本研究以‘烏龍嶺’龍眼葉片為材料,采用RT-PCR和RACE技術(shù),克隆出查爾酮合成酶(CHS)和查爾酮異構(gòu)酶(CHI)基因,以及脫氫抗壞血酸還原酶(DHAR)cDNA的全長。黃酮類化合物合成關(guān)鍵酶基因的克隆為進(jìn)一步利用基因工程技術(shù)開發(fā)黃酮類化合物奠定分子生物學(xué)基礎(chǔ)。DHAR基因全長的克隆為進(jìn)一步從分子水平了解植物抗壞血酸氧化還原系統(tǒng)和抗逆作用機制奠定理論基礎(chǔ)。
　　 1.利用RT-PCR和RACE技術(shù)克隆龍眼葉片CHS基因全長<

2、br>　　 龍眼葉片CHS基因cDNA全長為1298 bp(GenBank登錄號為JF718282),開放閱讀框為1200 bp,編碼393個氨基酸,分子量42.947 kD,等電點5.90。將龍眼葉片CHS全長經(jīng)過BLAST軟件比對,該序列與荔枝CHS基因的同源性較高,為96％；其次與白鮮、銀白楊、毛果楊、甜橙、蕓香同源性也比較高,分別為83％、81％、80％、80％、80％；并對其氨基酸序列進(jìn)行比對發(fā)現(xiàn),龍眼葉片的CHS蛋白與荔枝

3、、白鮮、銀白楊、葡萄、甜橙、沉香同源性也比較高,均達(dá)98％以上。經(jīng)保守區(qū)功能區(qū)的分析,推導(dǎo)出CHS蛋白擁有兩個保守區(qū)域,CHS-like酶家族和CHS酶家族區(qū)域。CHS蛋白序列經(jīng)跨膜和二級結(jié)構(gòu)的預(yù)測,發(fā)現(xiàn)有一個跨膜區(qū)域,位于365～382位,蛋白結(jié)構(gòu)主要以螺旋和線狀結(jié)構(gòu)為主。
　　 2.利用RT-PCR和RACE技術(shù)克隆龍眼葉片CHI基因全長
　　 龍眼葉片CHI基因cDNA全長為1011 bp(GenBank登錄號為J

4、F718281),開放閱讀框為743 bp,編碼246個氨基酸,分子量26.841 kD,等電點5.22。將龍眼葉片CHI全長經(jīng)過BLAST軟件比對,該序列與荔枝CHI基因的同源性較高,為98％；其次與蜜柑、甜橙、柚子、西洋梨、沙梨同源性也比較高,分別為82％、82％、81％、79％、80％；并對其氨基酸序列進(jìn)行比對發(fā)現(xiàn),龍眼葉片的CHI蛋白與沙梨、金花茶、狐臭葡萄、文旦柚、毛果楊、牡丹同源性也比較高,同源性在87％～92％之間。經(jīng)保守

5、區(qū)功能區(qū)的分析,推導(dǎo)出CHI蛋白擁有一個保守區(qū)域,查爾酮超級家族區(qū)域。CHI蛋白序列經(jīng)跨膜和二級結(jié)構(gòu)的預(yù)測,發(fā)現(xiàn)位于此段CHI的cDNA序列沒有明顯的跨膜結(jié)構(gòu),蛋白結(jié)構(gòu)主要以螺旋和線狀結(jié)構(gòu)為主。
　　 3.利用RT-PCR和RACE技術(shù)克隆龍眼葉片DHAR基因全長
　　 龍眼葉片DHAR基因cDNA全長為1038 bp(GenBank登錄號為JF718283),開放閱讀框為552 bp,編碼183個氨基酸,分子量20.5

6、84 kD,等電點5.29。將龍眼葉片DHAR全長經(jīng)過BLAST軟件比對,該序列與毛果楊DHAR基因的同源性較高,為79％；其次與蘋果、甘藍(lán)、芥菜、擬南芥、馬鈴薯同源性也比較高,分別為78％、78％、78％、77％、77％；并對其氨基酸序列進(jìn)行比對發(fā)現(xiàn),龍眼葉片的DHAR蛋白與蘋果、水稻、毛果楊、玉米須、蓖麻、擬南芥同源性也比較高,均達(dá)99％。經(jīng)保守區(qū)功能區(qū)的分析,推導(dǎo)出DHAR蛋白擁有兩個保守區(qū)域,GST C DHAR超級家族和GST