人參、三七組方促血管生成的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制及相關(guān)臨床文獻評價.pdf

1、血管生成在缺血性疾病發(fā)病機制和治療中作用的研究已成為目前醫(yī)學(xué)研究的熱點課題。益氣活血中藥防治冠心病療效肯定,其改善心肌缺血與促進缺血心肌血管生成的相關(guān)性,已為大量臨床和實驗研究所證實,提示促血管生成可能是益氣活血藥治療冠心病的重要機制之一。本研究通過探討益氣活血藥促血管生成作用的分子機制,揭示其干預(yù)血管生成的作用環(huán)節(jié)和分子靶標,闡明益氣活血藥祛瘀生新的科學(xué)內(nèi)涵,旨在為中醫(yī)藥防治缺血性疾病提供新的實驗依據(jù)。
　　 本論文分為三部分

2、:文獻綜述、臨床文獻系統(tǒng)評價和基礎(chǔ)研究。
　　 文獻綜述部分,分別從中醫(yī)藥治療性血管生成的研究進展以及血管生成在冠心病防治中的研究進展兩個方面進行了綜述。
　　 臨床文獻評價部分,對1994年～2007年在科技期刊上公開發(fā)表的益氣活血中藥治療不穩(wěn)定心絞痛的臨床文獻進行系統(tǒng)評價。
　　 目的:對益氣活血中藥治療不穩(wěn)定心絞痛臨床研究進行系統(tǒng)評價。方法:①以[(中文標題:不穩(wěn)定心絞痛)AND(全部檢索條目:中醫(yī)or中藥

3、or中西醫(yī)結(jié)合)AND(全部檢索條目:益氣and活血)]的檢索式檢索中國生物醫(yī)學(xué)文獻光盤數(shù)據(jù)庫,年限為1994年1月至2007年12月。②由2位研究者按照文獻納入、排除標準獨立進行文獻篩選,意見不同者通過討論解決。③獲取文獻的相關(guān)研究特征資料,并加以評價。④對合格的隨機對照試驗,進行定量的Meta分析。結(jié)果:①共檢索到15個文獻。②經(jīng)兩次篩選,剔除不符合要求以及重復(fù)報道的文獻,最終共有6篇文獻入選評價。③對6篇文獻進行Meta分析程序,

4、總病例數(shù)僅385例,研究的質(zhì)量普遍不高。Meta分析顯示,加用益氣活血中藥進行干預(yù)對不穩(wěn)定心絞痛患者心絞痛癥狀的改善、心電圖的改善、血脂的改善較單純西醫(yī)基礎(chǔ)治療顯著提高。結(jié)論:益氣活血中藥干預(yù)不穩(wěn)定心絞痛在改善心絞痛的癥狀、心電圖表現(xiàn)以及改善血脂方面有一定的療效。但由于納入研究的病例數(shù)較少和質(zhì)量不高,還有待進一步研究。
　　 基礎(chǔ)研究部分,包括以下八個實驗研究。
　　 實驗一 HUVEC生長曲線測定
　　 目的:

5、明確不同細胞濃度、不同時間點HUVEC的生長情況,為后續(xù)實驗選用合適的細胞濃度及最佳的給藥時間做準備。
　　 方法:將6個濃度的細胞接種于96孔板中,每隔24h比色測定,連續(xù)5天,重復(fù)一次。
　　 結(jié)果:接種細胞后第2天,各細胞密度的生長均進入指數(shù)生長期。第3、4天,4×104個/ml,6×104個/ml,8×104個/ml3個濃度的細胞進入平臺期；第5天,1×104個/ml,2×104個/ml,3×104個/ml這3個

6、濃度的細胞還繼續(xù)增殖,而4×104個/ml的細胞已到飽和的密度；6×104個/ml,8×104個/ml兩個濃度的細胞第2天后逐漸進入飽和狀態(tài)。
　　 結(jié)論:選用2×104個/ml～3×104個/ml這個區(qū)間的細胞數(shù)接種:細胞接種36h后給藥作為后續(xù)實驗的基礎(chǔ)。
　　 實驗二人參、三七不同配比和時間點對HUVEC增殖的影響
　　 目的:探討人參、三七組方促HUVEC增殖的最佳劑量、兩藥比例和最佳作用時間。
　

7、　 方法:將人參和三七分別按照1:1,2:1,1:2三種配比制備成0.25mg/ml、0.5mg/ml、1mg/ml、2mg/ml、4mg/ml15個不同濃度的給藥組和1個空白組,分別在給藥24 h和48 h后比色測定。
　　 結(jié)果:三種配比的不同濃度作用于HUVEC24 h后,只有人參、三七之比為2:1時,出現(xiàn)一定的量效關(guān)系,且4 mg/ml對細胞的增殖作用最強,增值率達37.3％；作用于HUVEC48 h后,三個配比均出現(xiàn)

8、一定的量效關(guān)系,人參:三七=1:1,濃度4mg/ml促細胞的增殖作用最強,增值率達26.12％。
　　 結(jié)論:人參、三七為2:1,濃度4mg/ml,藥物作用時間為24h時,促HUVEC增殖作用最明顯。
　　 實驗三人參、三七組方促HUVEC增殖及分泌VEGF的研究
　　 目的:探討人參、三七組方對臍靜脈內(nèi)皮細胞增殖及分泌VEGF的影響。
　　 方法:細胞分為對照組、bFGF陽性對照組、人參三七大劑量組、人

9、參三七中劑量、人參三七小劑量組,給藥24 h比色測定。用雙抗體夾心ELISA法,檢測上清中VEGF的含量。
　　 結(jié)果:人參、三七組方能夠促進HUVEC增殖和分泌VEGF,其作用和bFGF相當,與空白組有顯著性差異。
　　 結(jié)論:人參、三七組方能夠促進HUVEC增殖和分泌VEGF.
　　 實驗四人參、三七組方對HUVEC VEGFR-2表達的影響
　　 目的:探討人參、三七組方對HUVEC VEGFR-2

10、表達的影響。
　　 方法:采用免疫組織化學(xué)的方法,觀察人參、三七組方干預(yù)后,HUVECVEGFR-2的表達。
　　 結(jié)果:人參、三七組方大劑量組促進了HUVEC VEGFR-2的表達。其作用和bFGF相當,和空白組相比有明顯增加,且組間差異顯著。
　　 結(jié)論:人參、三七組方可能通過促進VEGFR-2的表達而促進HUVEC的增殖。
　　 實驗五人參、三七組方對血管生成信號蛋白及其mRNA的影響
　　

11、 目的:探討人參、三七組方對HUVEC的血管生成信號蛋白及mRNA的影響
　　 方法:人參、三七組方干預(yù)后,運用Western-blotting檢測方法,分析該組方對HUVEC的VEGFR-2、Ras、MAPK表達的影響；運用realtime-PCR對以上三種蛋白的mRNA表達進行分析。
　　 結(jié)果:人參、三七組方可不同程度的促進血管生成信號蛋白VEGFR-2、Ras、MAPK的表達,但是這三種蛋白的mRNA表達卻有不同

12、程度的降低。
　　 結(jié)論:人參、三七組方可促進血管生成信號蛋白VEGFR-2、Ras、MAPK的表達,這可能是中藥促進內(nèi)皮增殖,產(chǎn)生促血管生成的基礎(chǔ)。這三種蛋白mRNA表達的下降可能與其擴增時間相關(guān)。
　　 實驗六 SU5416對下游信號蛋白的影響以及中藥的干預(yù)作用
　　 目的:探討中藥在血管生成信號通路上的作用靶點。
　　 方法:用IC50的SU5416對HUVEC VEGFR-2進行阻斷,運用West

13、ern-blotting檢測方法,觀察人參、三七組方對下游信號蛋白Ras、MAPK表達的影響。
　　 結(jié)果:IC50的SU5416對HUVEC VEGFR-2阻斷后,人參、三七組方干預(yù)后,可以增加下游信號蛋白Ras、MAPK的表達。
　　 結(jié)論:人參、三七組方可直接作用在血管生成信號通路上Ras蛋白上,促進其表達,但還不能說明中藥可直接作用在MAPK這一上。
　　 實驗七 FPP對下游信號蛋白MAPK的影響以及中

14、藥的干預(yù)作用
　　 目的:探討人參、三七組方在血管生成信號通路上的作用靶點。
　　 方法:用IC50的FPP對HUVEC Ras進行阻斷,運用Western-blotting檢測方法,觀察人參、三七組方對下游信號蛋白MAPK的表達。
　　 結(jié)果:IC50的FPP對HUVEC Ras阻斷后,人參、三七組方干預(yù)后可以增加下游信號蛋白MAPK的表達。
　　 結(jié)論:人參、三七組方可直接作用在血管生成信號通路上的M

15、APK蛋白上。
　　 實驗八三維培養(yǎng)臍靜脈內(nèi)皮細胞形成血管樣結(jié)構(gòu)的研究
　　 目的:比較二維與三維細胞培養(yǎng)模型之間的差異,模擬血管生成的真實環(huán)境。
　　 方法:分別采用24孔培養(yǎng)板和Transwell小室進行二維和三維細胞培養(yǎng),通過倒置相差顯微鏡比較二維與三維細胞培養(yǎng)之間的差異,并利用激光共聚焦顯微鏡觀察HUVEC在膠原中血管樣結(jié)構(gòu)的形成。
　　 結(jié)果:在二維細胞培養(yǎng)中,HUVEC出現(xiàn)經(jīng)典的鋪路石樣改變；

16、在三維細胞培養(yǎng)中,出現(xiàn)從零星的不完整的網(wǎng)狀逐漸演變成管腔樣結(jié)構(gòu)。
　　 結(jié)論:利用Transwell小室成功構(gòu)建HUVEC的三維培養(yǎng)體系,真實地模擬了在體血管新生的過程,從而可以更加準確和真實地評價血管生成作用。
　　 小結(jié)
　　 利用Transwell小室成功構(gòu)建HUVEC的三維培養(yǎng)體系。
　　 人參三七組方可以促進HUVEC增殖,并可促進HUVEC分泌VEGF。
　　 人參三七組方可以直接作用