氯丙咪嗪調控神經干-祖細胞增殖和分化的分子機制.pdf

1、抑郁癥是全球性嚴重危害人類健康的主要疾病之一。抑郁癥的發(fā)病率逐年遞增，已上升到全球普通疾病前10位。而其10％～15％的高自殺率已引起人們的高度重視。1994年美國國家疾病譜調查(NCS)結果表明，抑郁癥終身患病率為17.1％，男性為12.7％，女性為21.3％。美國于2003年進行的再次疾病譜調查結果顯示：抑郁癥的終身患病率為16％。而在中國，尚無關于抑郁癥人群的最新統計數字，目前的統計數字來自1982年。據最保守的估計，目前中國內地

2、抑郁癥發(fā)病率約為2.4％，即抑郁癥患者已超過2600萬人。抑郁癥現狀的嚴峻，表明我們所生存的時代的心理健康狀況不容樂觀，同時也給世界各國的醫(yī)學專家、科研人員和政府機構提出了迫切的要求：加強抑郁癥及抗抑郁治療的機制研究，提高防治和康復的水平。
　　 在機制研究方面：最經典的是單胺類遞質假說，即5-羥色胺(5-HT)和去甲腎上腺素(NE)功能低下，這一論點成為抑郁癥機制研究的奠基石已逾50年。由此而發(fā)展起來的抗抑郁藥物：三環(huán)類抗抑郁

3、藥(TCAs)、5-HT重攝取抑制劑(SSRIs)和單胺氧化酶抑制劑(MAOIs)等，至今為止仍為臨床一線抗抑郁藥。這些藥物在數十分鐘或者數小時內即可顯著增加突觸間隙內單胺類遞質濃度，但是其發(fā)揮臨床療效，改善癥狀往往需要4-6周的時間。對于這一臨床藥理學現象，到目前為止，許多針對單胺類遞質轉運體、受體的研究都未能滿意地予以解釋。
　　 近年來提出的神經發(fā)生(neurogenesis)假說使神經科學研究者有希望更深入地闡明抗抑郁藥

4、起效遲緩的臨床藥理現象?？挂钟羲幷T導神經干/祖細胞增殖、分化，進而使新生神經元整合進入神經網絡所需的時間(2-4周)與臨床抗抑郁藥的起效延遲十分吻合[8]?？茖W家們推測抗抑郁藥治療可能通過誘導海馬新生神經元的產生，促進成年大腦邊緣皮層正常功能的恢復而發(fā)揮臨床療效。很多研究，包括本實驗室的研究結果表明--大多數抗抑郁藥物(TCAs，SSRIs等)呈現抗抑郁效果的同時可以顯著促進神經發(fā)生的恢復，局部放射性照射阻斷海馬顆粒細胞下區(qū)(SGZ)神

5、經發(fā)生的同時也拮抗抗抑郁藥的抗抑郁效果。而且，只有在慢性持續(xù)給藥而非急性大劑量給藥情況下，抗抑郁藥物才能誘導神經發(fā)生，這與抗抑郁藥發(fā)揮臨床療效具有相同的時程性。此外，神經營養(yǎng)因子(促進神經發(fā)生)具有抗抑郁效果。相關實驗結果說明神經網絡和海馬等邊緣皮層的信息聯系的受損和退變可能是抑郁癥發(fā)病的關鍵因素，而抗抑郁藥則很有可能通過促進神經發(fā)生，誘導新生神經元的產生，并促進其遷移、分化、成熟，并與現有神經網絡進行整合，從而使受損的邊緣腦區(qū)的功能恢

6、復，達到治療效果。
　　 那么，抗抑郁藥究竟如何調控成年海馬的神經發(fā)生呢?近年來，有科學家推測，抗抑郁藥調控成年海馬神經發(fā)生可能是通過上調海馬SGZ區(qū)內的5-HT濃度，繼而通過5-HT的受體，發(fā)揮神經遞質/營養(yǎng)作用，從而促進海馬內神經發(fā)生的恢復。但是一直未能在在體的神經干/祖細胞上發(fā)現5-HT受體表達，同時，5-HT遞質系統的纖維投射也僅到達了海馬齒狀回(DG)的海馬門的部位。并且到目前為止，無實驗證據表明5-HT能神經纖維與海

7、馬SGZ區(qū)的神經干/祖細胞有直接的突觸聯系，這些都使抗抑郁藥通過上調5-HT而間接調控神經干/祖細胞這一假說受到質疑。此外，上述各種抗抑郁藥作為一種小分子物質，可以穿過血腦屏障，進入任何一個腦區(qū)，包括擴散入海馬內的SGZ區(qū)，SGZ區(qū)又被認為是海馬神經發(fā)生微環(huán)境(the Neurogenic Niche)。那么，這類小分子藥物是否可以發(fā)揮直接作用，直接調控神經干/祖細胞的增殖、遷移、分化、成熟等步驟?已有一些離體實驗表明SSRIs及三環(huán)類

8、抗抑郁藥對神經干/祖細胞具有直接促增殖、促分化作用。但是，真正要確認抗抑郁藥對神經干/祖細胞的直接調控作用，還需進一步的深入研究。而抗抑郁藥對神經干/祖細胞直接調控作用能得到確認之后，這一調控作用的胞內分子機制的特點則將成為下一步研究的重點。
　　 根據我們前期在動物實驗中得出的結果：三環(huán)類抗抑郁藥在多種抑郁癥動物模型中都具有良好的抗抑郁作用，而且，在慢性不可預知的復合刺激誘導的抑郁癥大鼠模型中，氯丙咪嗪不但具有良好的抗抑郁作用

9、同時顯著恢復由于應激刺激而抑制的海馬的神經發(fā)生，促進新生神經元、膠質細胞的產生。因此，本篇論文選用氯丙咪嗪進行離體細胞實驗，是為了進一步闡明抗抑郁藥調控神經發(fā)生的相關胞內分子機制。同時闡明氯丙咪嗪調控神經干/祖細胞增殖或分化的胞內信號分子也將為進一步尋找新的治療靶點提供依據。越來越多的研究關注調控神經發(fā)生的細胞內信號通路。例如cAMP-CREB信號通路可能參與調控新生神經元的存活。因為激活cAMP-CREB信號通路可以增加海馬內BDNF

10、的表達，繼而增加成年腦內的神經發(fā)生。這有可能是抑郁癥或抗抑郁治療影響海馬神經發(fā)生的途徑之一?，F有結果暗示CREB可能是多種抗抑郁藥物的作用匯聚點。但是到目前為止這一假說仍然只有極少量的研究支持。我們的研究可能為這方面的研究增加新的證據。此外，這一信號通路的激活引起的下游靶基因的變化也是本研究的另一靶點。
　　 總之，揭示抗抑郁藥調控海馬神經發(fā)生的分子機制，將為深入闡明其治病機理及抑郁癥發(fā)病機制提供新的突破點；也為尋求新治療靶點，

11、探索新治療方法開拓新思路，為提高臨床療效提供理論依據和實驗基礎。
　　 本論文從兩個方面闡明抗抑郁藥調控海馬神經干/祖細胞增殖、分化的分子機制。首先，在體外培養(yǎng)的神經干/祖細胞系統中，觀察三環(huán)類抗抑郁藥氯丙咪嗪是否可以直接調控海馬神經干/祖細胞：a)建立體外海馬神經干/祖細胞培養(yǎng)體系；b)明確氯丙咪嗪對海馬神經干/祖細胞的增殖、分化的作用；c)同時明確具有直接調控作用的氯丙咪嗪的最佳劑量；其次，進一步通過分子生物學方法，探尋三環(huán)

12、類抗抑郁藥氯丙咪嗪直接調控成年海馬神經干/祖細胞的胞內分子機制：a)觀察胞內信號分子在氯丙咪嗪調控神經干/祖細胞增殖時的表達差異；b)利用工具藥調控胞內信號分子磷酸化，繼而觀察對氯丙咪嗪調控神經干/祖細胞分化、增殖作用的影響；c)利用基因表達芯片尋找相關信號分子下游的靶基因。
　　 主要實驗結果如下：
　　 1)三環(huán)類抗抑郁藥氯丙咪嗪可以直接調控海馬神經干/祖細胞a)建立穩(wěn)定的體外海馬神經干/祖細胞培養(yǎng)體系體外培養(yǎng)的海馬

13、神經干/祖細胞可以在體外培養(yǎng)環(huán)境中穩(wěn)定增殖，并且在撤除促有絲分裂因子后，貼壁分化，可以分化出神經元、星型膠質細胞及少突膠質細胞。
　　 b)明確氯丙咪嗪對海馬神經干/祖細胞的增殖、分化的作用在bFGF/EGF存在情況下，氯丙咪嗪可以協同bFGF/EGF進一步促進海馬神經干/祖細胞的增殖，而在分化培養(yǎng)基中，氯丙咪嗪具有促進神經干/祖細胞分化的作用，其中神經膠質細胞分化明顯增多。
　　 c)明確具有直接調控作用的氯丙咪嗪的最

14、佳劑量在觀察氯丙咪嗪的促分化和增殖作用時顯示，2μM和5μM的氯丙咪嗪具有明顯的促增殖和分化的作用，而20μM的氯丙咪嗪已經明顯的抑制增殖和分化的作用2)明確三環(huán)類抗抑郁藥氯丙咪嗪直接調控成年海馬神經干/祖細胞的胞內分子機制a)胞內信號分子在氯丙咪嗪調控干/祖細胞分化、增殖時的表達差異胞內多條信號分子參與干/祖細胞增殖與分化過程，其中c-Srk，Rsk，ERK等信號分子可能參與了氯丙咪嗪調控神經干/祖細胞的胞內信息傳遞。
　　

15、b)利用工具藥調控胞內信號分子對氯丙咪嗪調控神經干/祖細胞增殖作用的影響根據胞內信號分子的時程變化，在18h和42h分別給予p-ERK的抑制劑PD98059和U0126，發(fā)現可以部分拮抗氯丙咪嗪的促增殖作用。
　　 c)利用基因表達芯片尋找相關信號分子下游的靶基因通過神經干細胞芯片檢測，在加有2μM的氯丙咪嗪的增殖培養(yǎng)基中培養(yǎng)的神經干/祖細胞與對照的神經干/祖細胞相比，GDNF的mRNA表達顯著上調。此外，氯丙咪嗪促分化的作用可

16、能與靶基因Bone morphogenetic protein15，Bonemorphogenetic protein8a，GDNF，Pleiotrophin表達上調及Neuropilin1表達下調相關。
　　 綜上所述，本研究可獲得以下結論：
　　 1.氯丙咪嗪具有促進海馬神經干/祖細胞的增殖與分化的作用2.氯丙咪嗪可能通過調控胞內信號分子ERK信號通路繼而促進靶基因GDNF表達而起到促增殖的作用3.氯丙咪嗪發(fā)揮促分化