貴州省豬圓環(huán)病毒2型的分離鑒定與遺傳變異分析.pdf

1、豬圓環(huán)病毒2型（Porcine circovirus type2, PCV2）系圓環(huán)病毒科、圓環(huán)病毒屬成員之一，屬于無囊膜單股環(huán)狀負(fù)鏈 DNA病毒，基因組大小約為1.8kb。由PCV2引起的各種疾病分布廣泛。鑒于目前臨床上很難有單一PCV2感染發(fā)病病例，豬圓環(huán)病毒2型常與豬瘟病毒（Classical swine fever virus, CSFV）、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine reproductive and respira

2、tory syndrome virus, PRRSV）或豬偽狂犬病毒（Pseudorabies virus, PRV）形成兩重或多重感染，并且PCV2與上述病毒均存在共同細(xì)胞嗜性，均能在豬腎細(xì)胞系（Porcine kidney cell line, PK15）中增殖，從而導(dǎo)致應(yīng)用傳統(tǒng)方法極難從病料樣品中通過細(xì)胞傳代方式分離獲得單純的PCV2病毒。然而，PCV2反向遺傳操作技術(shù)在該病毒的分離上具有獨特的優(yōu)勢，利用該技術(shù)可以從病料樣品中快速

3、擴(kuò)增獲取PCV2全基因組，通過構(gòu)建其感染性克隆，可實現(xiàn)病毒的拯救，從而實現(xiàn)從病料樣品中獲得單純的PCV2毒株，即完成病毒的分離。本論文擬利用實驗室建立的PCV2反向遺傳操作平臺，對六株不同來源病料樣品中的PCV2野毒進(jìn)行分離，比較分析不同來源PCV2毒株的分子遺傳特征。該研究一方面可以豐富貴州省PCV2分子流行病學(xué)調(diào)查資料，為PCV2的分離獲得提供新的策略；另一方面可為貴州省PCV2病毒庫建設(shè)，從中篩選免疫原性優(yōu)良的毒株提供技術(shù)參考，對

4、深入開展PCV2的疫苗免疫防控研究具有重要意義。
　　1、6株貴州省豬圓環(huán)病毒2型的分離與初步鑒定
　　應(yīng)用實驗室已建立的反向遺傳操作平臺，分別對臨床送檢的不同病癥PCV2陽性樣品，如流產(chǎn)胎兒、典型皮炎腎炎綜合癥發(fā)病豬血液樣品、多重感染的普通組織病料樣品和PCV2抗體檢測陽性的送檢血清樣品等，PCR擴(kuò)增其PCV2全基因組，經(jīng)與 pcDNA3.1(+)真核表達(dá)載體定向連接后，分別構(gòu)建了 ZYMT2015、ASXX2015、MJ

5、BM2015、GYYY2015、CSGS2012以及 GYXW2014樣品的pcDNA3.1(+)-PCV2感染性克隆質(zhì)粒。分別將構(gòu)建的上述感染性克隆質(zhì)粒，腹腔注射昆明小鼠進(jìn)行體內(nèi)病毒拯救后，取小鼠過濾血清接種至PK15細(xì)胞，連續(xù)傳代3次后，檢測并初步鑒定分離毒株。免疫過氧化物酶單層試驗（immunoperoxidase monolayer assay, IPMA）鑒定結(jié)果表明，在連續(xù)傳代3次后的PK15細(xì)胞中，可見感染細(xì)胞呈橘紅色特異

6、性著色；用特異性的檢測用引物，對細(xì)胞培養(yǎng)液進(jìn)行PCV2全基因組的PCR檢測鑒定，其結(jié)果表明均能擴(kuò)增出與預(yù)期相符的特異性DNA片段。初步鑒定結(jié)果表明，應(yīng)用已建立的反向遺傳操作平臺，成功地從不同病癥的多重病毒感染樣品中，分離獲得了6株P(guān)CV2毒株，即PCV2 ZYMT2015株，基因組大小為1767bp；PCV2 ASXX2014株，基因組大小為1767bp；PCV2 MJBM2015株，基因組大小為1766bp；PCV2 GYYY2015

7、株，基因組大小為1768bp；PCV2 CSGS2012株，基因組大小為1766bp；PCV2 GYXW2014株，基因組大小為1767bp。
　　2、6株豬圓環(huán)病毒2型貴州分離株遺傳變異分析
　　為了解分離毒株的遺傳變異特點，應(yīng)用生物信息學(xué)相關(guān)軟件對上述6株不同病癥來源的PCV2毒株，31株國內(nèi)外PCV2參考株，尤其是現(xiàn)有疫苗毒株（LG株、SH株）的基因組序列進(jìn)行比較了分析。全基因組核苷酸序列分析結(jié)果表明，與先前報道的含有

8、11個ORF的PMWS對照毒株（AF027217）相比，其遺傳變異主要表現(xiàn)在 ASXX2014、GYYY2015均含有10個 ORF（分別缺失 ORF9和ORF4），ZYMT2015、GYXW2014均只含有9個 ORF（分別均缺失 ORF8和ORF11）；CSGS2012株主要變異表現(xiàn)為ORF1的提前終止和ORF3的起始密碼子前置；MJBM2015主要變異表現(xiàn)為ORF1起始密碼子的后移動?；蚍中徒Y(jié)果表明MJBM2015、ASXX20

9、15株為PCV2b基因型，CSGS2012株、GYYY2015株為PCV2a基因型，ZYMT2015、GYXW2014株為PCV2d基因型。推導(dǎo)主要結(jié)構(gòu)蛋白的預(yù)測結(jié)果表明， ORF1、ORF2、ORF3編碼蛋白均為混合型蛋白；除CSGS2012、BJMJ2015的ORF1編碼蛋白的潛在磷酸化位點與參考毒株差異較大外，剩余毒株之間除絲氨酸磷酸化位點差異較大外，蘇氨酸、酪氨酸磷酸化位點完全相同；各毒株之間 ORF2編碼蛋白的潛在磷酸化位點均