應(yīng)用生物光譜技術(shù)研究細(xì)胞損傷和組織生長(zhǎng)的生物分子特征性變化.pdf

1、生物各種組織和細(xì)胞都由蛋白質(zhì)、核酸、脂類等生物分子組成，生物分子由于電子偶極矩化學(xué)鍵不同，因此每一種生物分子在生物光譜學(xué)上都有其特征性的振動(dòng)譜帶。細(xì)胞內(nèi)生物分子成分和（或）構(gòu)象發(fā)生變化，就會(huì)引起振動(dòng)譜帶精細(xì)的改變，而生物光譜技術(shù)如紅外光譜技術(shù)、拉曼光譜技術(shù)可以精確檢測(cè)和評(píng)價(jià)這些微觀的變化，從而反映組織或細(xì)胞的生物分子的特征性變化。不同的生物光譜學(xué)技術(shù)，雖然其工作原理不盡相同，但都具有快速、客觀、無創(chuàng)、重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn)。
　　由于生物

2、光譜實(shí)驗(yàn)通常將采集涵蓋復(fù)雜生物化學(xué)信息數(shù)據(jù)集的成百上千個(gè)圖譜，而且這些圖譜存在著很多的重疊性或只是細(xì)微的差異，因此對(duì)其圖譜的分析最好應(yīng)用多變量分析的方法，如主成份分析和/或線性判別分析。多變量分析不僅對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行了降維，判別組間差異，而且能夠容易鑒別獲取波數(shù)相關(guān)的生物標(biāo)記物，如糖原含量、脂質(zhì)含量、蛋白質(zhì)構(gòu)象變化和磷酸化作用以及DNA/RNA的結(jié)構(gòu)改變。
　　當(dāng)前，與環(huán)境致癌物相關(guān)的腫瘤發(fā)病率呈不斷上升趨勢(shì)，準(zhǔn)確地檢測(cè)環(huán)境致癌物的

3、人群暴露濃度以及研究其作用致癌機(jī)理，是預(yù)防和治療癌癥的重要任務(wù)之一。苯并芘是環(huán)境污染物中一種前畸變和前致癌物，是多環(huán)芳烴類化學(xué)物的典型代表。傳統(tǒng)上，遺傳毒性的短期評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)通常檢測(cè)的是高劑量（≥μmol/L）化學(xué)物的毒性，但根據(jù)這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)的生物學(xué)效應(yīng)，如何外推到與人群暴露背景水平相一致的低劑量污染物引起的生物學(xué)效應(yīng)仍然是不明確的。因此，探討能夠有效評(píng)價(jià)低劑量環(huán)境化學(xué)物的毒性及其毒理學(xué)機(jī)制的方法是非常迫切的。本研究應(yīng)用衰減全反射-傅立

4、葉變換紅外光譜技術(shù)探討和研究低劑量苯并芘（最低劑量低至nmol/L級(jí)別）對(duì)不同周期（S期和G0/G1期）的靶細(xì)胞的生物學(xué)改變和其毒作用機(jī)理。
　　正常組織生長(zhǎng)的生物分子特征變化的研究，不僅能更好地深入理解組織成分結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系，也會(huì)為組織的病理改變的研究、疾病的預(yù)防與治療提供更深的認(rèn)識(shí)。本研究還同時(shí)利用衰減全反射-傅立葉變換紅外光譜和拉曼光譜技術(shù)研究在雞胚胎10-18天期間，以每間隔1天的短時(shí)間點(diǎn)內(nèi)，持續(xù)追蹤角膜生長(zhǎng)、透明化過程中

5、生物分子的微觀改變。因此，不僅能夠?yàn)楦玫乩斫饨悄どL(zhǎng)過程中的結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系，也會(huì)為生物光譜技術(shù)用于正常組織學(xué)和病理學(xué)的研究提供新的視角。
　　因此，本研究運(yùn)用生物光譜技術(shù)（衰減全反射-傅立葉變換紅外光譜和/或拉曼光譜技術(shù)）及對(duì)圖譜的多變量分析方法探討細(xì)胞損傷和正常組織發(fā)生的生物分子特征性變化，為探討和評(píng)價(jià)細(xì)胞和組織的微觀變化提供新的手段和視角。
　　第一部應(yīng)用紅外光譜技術(shù)及多變量分析研究苯并芘誘導(dǎo)不同細(xì)胞周期的MCF-7乳

6、腺癌細(xì)胞的生物分子改變
　　目的：衰減全反射-傅立葉變換紅外光譜(ATR-FTIR)是一種通過無創(chuàng)性方式，鑒別研究細(xì)胞生物分子特征性變化的全新技術(shù)方法。本研究運(yùn)用ATR-FTIR光譜技術(shù)以及多變量分析研究不同劑量的B[a]P對(duì)不同周期的MCF-7乳腺癌細(xì)胞生化分子的影響。明確B[a]P的劑量-效應(yīng)關(guān)系、不同濃度的B[a]P對(duì)不同周期的靶細(xì)胞毒作用方式、不同周期的MCF-7乳腺癌細(xì)胞對(duì)B[a]P的易感性以及細(xì)胞損傷的判別性生物標(biāo)記物

7、。為研究和評(píng)價(jià)低劑量環(huán)境污染物對(duì)靶細(xì)胞的綜合生物學(xué)效應(yīng)提供一種新的手段和方法。
　　方法：1.用空白對(duì)照(DMSO)和系列濃度(10-9M，10-8M，10-7M，10-6M和10-5M)的B[a]P對(duì)S期或G0/G1期的MCF-7細(xì)胞進(jìn)行染毒培養(yǎng)24小時(shí)，細(xì)胞經(jīng)消化、洗滌、固定后應(yīng)用ATR-FTIR對(duì)其檢測(cè)。2.只用低劑量(10-9M)和高劑量（10-6M）的B[a]P對(duì)S期或G0/G1期的MCF-7細(xì)胞進(jìn)行染毒觀察其不同的誘導(dǎo)

8、效應(yīng)，細(xì)胞經(jīng)消化、洗滌、固定后應(yīng)用ATR-FTIR對(duì)其檢測(cè)。3.采用主成份分析和線性判別分析(PCA-LDA)對(duì)獲取的ATR-FTIR圖譜進(jìn)行變量分析。4.細(xì)胞(≈1.0×105/ml)接種培養(yǎng)24小時(shí)后，用低劑量(10-9M)、高劑量(10-6 M)的B[a]P和空白對(duì)照(DMSO)對(duì)其進(jìn)行染毒。在不同的時(shí)間點(diǎn)（0、12、24、48小時(shí)）細(xì)胞經(jīng)洗滌、消化、重懸后用血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。
　　結(jié)果：1.PCA-LDA一維和二維得

9、分圖表明，不同濃度的B[a]P對(duì)不同周期MCF-7細(xì)胞都存在著劑量-效應(yīng)關(guān)系。與對(duì)照組相比，較高濃度B[a]P處理組（10-6 M或10-5 M）的圖譜點(diǎn)比低濃度處理組區(qū)分度更高、差異更明顯。ANOVA檢驗(yàn)結(jié)果表明所有的處理組與對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P≤0.001）。2.在實(shí)驗(yàn)Ⅱ中，無論是S期還是G0/G1期的MCF-7細(xì)胞，與對(duì)照組相比，一維和二維的得分圖都表明高劑量的B[a]P與低劑量的B[a]P相比具有更明顯的差異性、區(qū)

10、分度更高。在S期，高劑量(10-6 M)導(dǎo)致的主要生物學(xué)改變是DNA/RNA、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)(酰胺酶Ⅰ和酰胺酶Ⅲ)、脂肪酸和氨基酸;而低劑量（10-9M）導(dǎo)致的主要改變是蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)(酰胺酶Ⅰ、酰胺酶Ⅱ和酰胺酶Ⅲ)和脂質(zhì)。然而，高劑量和低劑量的B[a]P引起G0/G1期MCF-7細(xì)胞圖譜改變的區(qū)域都集中在蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)、DNA/RNA、脂肪酸和氨基酸的COO-鍵。3.MCF-7細(xì)胞暴露于高劑量(10-6 M)、低劑量(10-9

11、 M) B[a]P和對(duì)照(DMSO)后，隨著時(shí)間的改變而導(dǎo)致不同的生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)改變。處理12小時(shí)后，不同的處理組之間沒有明顯的差異;而24小時(shí)后，高濃度的B[a]P導(dǎo)致MCF-7細(xì)胞數(shù)目的急劇增加。然而，作用時(shí)間達(dá)到48小時(shí)后，高濃度的B[a]P引起細(xì)胞數(shù)目明顯下降，而低劑量(10-9 M) B[a]P與對(duì)照組相比，生長(zhǎng)曲線基本類似。
　　結(jié)論：B[a]P可誘導(dǎo)不同周期MCF-7細(xì)胞產(chǎn)生明顯的生物學(xué)改變，而且存在著劑量-效應(yīng)關(guān)系;圖

12、譜改變的區(qū)域主要集中在DNA/RNA、蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)和脂質(zhì)。紅外線光譜技術(shù)及多變量分析方法為更好地研究低劑量環(huán)境污染物的生物學(xué)效應(yīng)提供了一種全新的手段，該方法可以充分顯示環(huán)境化學(xué)物引起的綜合生物學(xué)效應(yīng)。
　　第二部分應(yīng)用生物光譜技術(shù)和多變量分析研究雞胚胎角膜生長(zhǎng)發(fā)育的生物分子特征性變化
　　目的：生物光譜技術(shù)越來越被公認(rèn)為其是一種可以檢測(cè)鑒別復(fù)雜生物結(jié)構(gòu)特征性變化的嶄新無創(chuàng)性工具。本研究應(yīng)用生物光譜技術(shù)研究雞胚胎角膜透明度從

13、起始到生長(zhǎng)發(fā)育各階段生物分子的特征性變化。為更好深入理解角膜生長(zhǎng)發(fā)育過程中的結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系，以及生物光譜技術(shù)應(yīng)用于正常組織學(xué)和病理學(xué)的研究提供新的視角。
　　方法：在雞蛋孵化期10天到18天期間，以每2天的間隔期（第10，12，14，16，18天），獲取雞胚胎眼角膜(n=46)，并分別應(yīng)用衰減全反射傅立葉紅外光譜(ATR-FTIR)和拉曼光譜技術(shù)對(duì)其檢測(cè)。采用主成份分析和線性判別分析(PCA-LDA)對(duì)獲取的圖譜進(jìn)行變量分析。

14、r>　　結(jié)果：1.ATR-FTIR光譜和拉曼光譜在胚胎每個(gè)檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)的均值譜均有較大程度的重疊，但第10天的均值圖譜DNA的信號(hào)強(qiáng)度明顯增強(qiáng)(1080cm-1);2.無論是ATR-FTIR光譜還是拉曼光譜，在PCA-LDA一維，二維或三維得分圖中各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的雞角膜標(biāo)本顯著分離，間隔天數(shù)越大圖譜點(diǎn)的交叉性越少，ANOVA檢驗(yàn)結(jié)果表明其余檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)與角膜透明度起始時(shí)間點(diǎn)孵化期第10天相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P≤0.001）;3.兩分類的判

15、別分析進(jìn)一步清晰顯示在角膜組織成熟的過程中分子特征性改變;4.在雞角膜發(fā)育的第10天和18天兩分類比較，ATR-FTIR光譜技術(shù)發(fā)現(xiàn)主要的生物標(biāo)記物是DNA/RNA(1126 cm-1)，糖原(1045 cm-1)，蛋白質(zhì)(1470 cm-1)酰胺酶Ⅱ（1512 cm-1和1524 cm-1）;5.拉曼光譜研究也顯示在雞胚胎角膜組織成熟的過程中主要的生物標(biāo)記物是蛋白質(zhì)，氨基酸（酪氨酸，比咯氨酸，苯丙氨酸，纈氨酸）和蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)（酰胺