維康顆粒對疲勞型亞健康大鼠下丘腦蛋白譜的影響.pdf

1、背景： 20世紀(jì)80年代中期，前蘇聯(lián)布赫曼教授通過研究發(fā)現(xiàn)，除了健康狀態(tài)和疾病狀態(tài)之外，人體還存在著一種非健康非患病的中間狀態(tài)，稱為亞健康狀態(tài)(sub-healthstatus)。世界衛(wèi)生組織的一項全球性調(diào)查表明，真正健康的人僅占5％，患有疾病的人占20％，而75％的人處于亞健康狀態(tài)。亞健康狀態(tài)在經(jīng)濟(jì)發(fā)達(dá)、社會競爭激烈的國家和地區(qū)中普遍存在，人數(shù)一直呈逐年增加的趨勢，成為國際上醫(yī)學(xué)界研究的熱點之一。亞健康的臨床表現(xiàn)多種多樣，而通

2、過本課題組的大規(guī)模亞健康流行病學(xué)調(diào)查研究表明，其中疲勞不僅是亞健康狀態(tài)的重要臨床表現(xiàn)之一，也是導(dǎo)致亞健康發(fā)生發(fā)展的重要原因，疲勞型亞健康是亞健康的主要類型之一。因此，闡明疲勞型亞健康的發(fā)生機(jī)制，不僅有助于深入亞健康的病因?qū)W研究，而且可以采取積極的措施干預(yù)疲勞型亞健康的發(fā)生發(fā)展，會對疲勞型亞健康的防治產(chǎn)生積極的影響，進(jìn)入良性循環(huán)，向健康方向轉(zhuǎn)化。在目前有關(guān)疲勞型亞健康的研究中，建立較理想的疲勞型亞健康模型是研究得以深入的關(guān)鍵。然而目前尚未

3、有比較理想、公認(rèn)的疲勞型亞健康模型，而動物實驗作為現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)研究中的一個極為重要的實驗方法和手段，具有可控性好、結(jié)果易獲得、簡便性好、容易復(fù)制等優(yōu)點，為研究疲勞型亞健康的發(fā)生、發(fā)展規(guī)律及防治措施，研制疲勞型亞健康動物模型具有重要的意義。以往研究表明下丘腦在疲勞的形成中起有重要的調(diào)節(jié)作用，而蛋白質(zhì)組學(xué)雙向電泳技術(shù)為研究疲勞發(fā)生機(jī)制新的有效技術(shù)手段。因此，通過制備疲勞型亞健康大鼠模型，利用蛋白質(zhì)組學(xué)的實驗技術(shù)，著手于整體，全面觀察疲勞型亞

4、健康大鼠以及維康顆粒干預(yù)后疲勞型亞健康大鼠的下丘腦蛋白譜變化，為進(jìn)一步識別疲勞型亞健康的生物標(biāo)志物，探討疲勞型亞健康發(fā)生發(fā)展機(jī)制，以及維康顆?？蛊谛蛠喗】档南嚓P(guān)作用機(jī)制提供研究基礎(chǔ)。 目的： 建立疲勞型亞健康大鼠模型，運用蛋白質(zhì)組學(xué)雙向電泳技術(shù)初步研究疲勞型亞健康的發(fā)生機(jī)理，及維康顆?？蛊谛蛠喗】档淖饔脵C(jī)制。 方法： 1.運用睡眠剝奪和負(fù)重力竭游泳的復(fù)合方法進(jìn)行造模，即將模型組大鼠放入水深1.5cm的

5、盒子中剝奪睡眠，按其體質(zhì)量5％負(fù)重后再于水深50cm的玻璃缸內(nèi)進(jìn)行力竭游泳訓(xùn)練，以沉入水中10s無法浮出水面判定達(dá)到力竭狀態(tài)；正?？瞻讓φ战M不給予任何刺激，自然飼養(yǎng)。經(jīng)兩次實驗確定睡眠剝奪強(qiáng)度和總的造模時間，以建立疲勞型亞健康大鼠模型，以力竭游泳時間和大鼠血液生化指標(biāo)為衡量標(biāo)準(zhǔn)，對建立的模型進(jìn)行評估。 實驗一：確定睡眠剝奪強(qiáng)度，將SPF級健康雄性SD大鼠32只，隨機(jī)分為20h/d(每天剝奪睡眠時間20h)、16h/d(每天剝奪睡

6、眠時間16h)、12h/d模型組(每天剝奪睡眠時間12h)和空白對照組(不剝奪睡眠)，每組8只，將模型組大鼠負(fù)重力竭游泳13d，觀察大鼠力竭游泳時間的變化，試驗結(jié)束后.采大鼠血清檢測生化ALT、AST、TP、A1b、TBIL、BUN、Scr、UA、LDH、CK、GLU、TG、Tch及CRP值，對照空白組分析各實驗組生化值的變化，依據(jù)上述兩項內(nèi)容確定大鼠睡眠剝奪強(qiáng)度。 實驗二：確定造模時間，依據(jù)實驗一力竭游泳時間和生化值的變化，確

7、定實驗組為1d(造模時間為1d)、4d(造模時間為4d)、5d(造模時間為5d)實驗組和空白對照組，采各組大鼠血清檢測生化ALT、AST、TP、A1b、TBIL、BUN、Scr、UA、LDH、CK、GLU、TG、Tch及CRP值，空白對照組分析各實驗組生化值的變化，以確定造模天數(shù)。 2.在造模過程中給予大鼠維康顆粒干預(yù)，比較給藥組、未給藥模型組及空白對照組，以力竭游泳時間為衡量疲勞的標(biāo)準(zhǔn)，觀察維康顆?？蛊谧饔?。 3.統(tǒng)

8、計學(xué)分析采用SPSS13.0forwindows統(tǒng)計軟件包處理，同組不同時間點間比較、多個處理組與一個空白對照組比較采用單向方差分析(One-WayANOVA)；重復(fù)測量資料采用重復(fù)測量數(shù)據(jù)的方差分析，顯著性水準(zhǔn)a=0.05，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。 4.運用蛋白質(zhì)組學(xué)雙向電泳技術(shù)，對正常組、模型組及給藥組大鼠下丘腦蛋白點分離，依據(jù)蛋白圖譜分析軟件PDQuest分析下丘腦蛋白譜，發(fā)現(xiàn)有差異的蛋白點，找到與疲勞型亞健康發(fā)生

9、及維康顆?？蛊谧饔脵C(jī)制相關(guān)的蛋白。 結(jié)果： 1.實驗一：20h模型組力竭游泳時間隨著實驗天數(shù)的增加出現(xiàn)明顯的改變，呈逐漸降低的趨勢，第13d與第0d相比較明顯縮短，差異有顯著的統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，同時血清生化AST、LDH、ALB、GLU、Tch出現(xiàn)了明顯的異常，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，0.01)。16h、12h模型組力竭游泳時間隨著造模天數(shù)的增加并無下降，且生化指標(biāo)與正常組相比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P

10、>0.05)。 2.實驗二：與空白對照組比較，5d模型組中AST、ALT、BUN、Scr、HBDH、CK、TG、Tch水平有明顯的改變，差異有明顯的統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，0.01)，1d、4d模型組大鼠生化值差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。 3.造模4d后兩組大鼠力竭游泳時間相比較，給藥組大鼠力竭游泳時間明顯延長，兩組之間差異有顯著的統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。 4.運用蛋白質(zhì)組學(xué)雙向電泳技術(shù)分別對空白對照

11、組、模型組、維康顆粒高劑量給藥組大鼠下丘腦蛋白進(jìn)行蛋白點的2-D分離，與空白對照組相比較，模型組共有71個點有明顯差異，維康顆粒高劑量給藥組有65個蛋白點有明顯差異，其中模型組中蛋白點表達(dá)上升2倍及以上的點有18個，下降2倍及以上的點有15個；給藥組中蛋白點表達(dá)上升2倍以上的點有12，下降2倍及以上的點有9個。其中模型組與空白對照組的差異71個點中，有32個差異點經(jīng)維康顆粒干預(yù)后，有明顯恢復(fù)，接近于正常。這些蛋白質(zhì)的存在，可能與疲勞型亞