IL-37的表達(dá)、純化及其抑制膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎的作用.pdf

1、目的：
　　白細(xì)胞介素(IL)-37是IL-1家族的新成員，共有五種不同亞型(IL-37a-e)，目前研究表明只有 IL-37b具有生物學(xué)功能并在多種疾病中具有抗炎作用。IL-37既可以分泌到細(xì)胞外作為細(xì)胞因子與受體結(jié)合調(diào)節(jié)細(xì)胞活性，也可以進(jìn)入細(xì)胞核作為轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子。IL-37與IL-18具有較高的同源性，可以結(jié)合IL-18結(jié)合蛋白(IL-18BP)對(duì)IL-18信號(hào)通路有一定的抑制作用。最新研究發(fā)現(xiàn)，類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的滑膜組織中IL-

2、37表達(dá)升高。
　　類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎是一種人體自身免疫性疾病，其特征表現(xiàn)為慢性滑膜炎癥，隨著疾病的進(jìn)展，可能會(huì)損壞關(guān)節(jié)軟骨和骨質(zhì)，最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)畸形和殘疾。因此，類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎給病人帶來(lái)了極大的痛苦，生活質(zhì)量受到嚴(yán)重的影響。類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的發(fā)病與多種炎癥因子有必然的聯(lián)系，因?yàn)镮L-37具有一定的抗炎作用，所以本研究擬構(gòu)建 IL-37真核、原核表達(dá)載體并表達(dá)純化 IL-37蛋白，以及構(gòu)建 IL-37慢病毒表達(dá)載體，利用純化所得蛋白和包裝的慢病

3、毒，研究IL-37對(duì)膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎模型（CIA）的影響。
　　方法：
　　1.從人的皮膚組織中提取總 RNA，IL-37全長(zhǎng)編碼序列通過(guò) RT-PCR擴(kuò)增，構(gòu)建 IL-37真核表達(dá)載體：pcDNA-3.1(+)-IL-37。
　　2.以pcDNA-3.1(+)-IL-37為模板擴(kuò)增IL-37成熟肽編碼序列，構(gòu)建IL-37原核表達(dá)載體：pET-44-IL-37。
　　3.IPTG誘導(dǎo)表達(dá)IL-37蛋白質(zhì)，利用蛋白C

4、末端的組氨酸標(biāo)簽（His tag）純化IL-37蛋白質(zhì)，并去除內(nèi)毒素。
　　4.以pcDNA-3.1(+)-IL-37為模板擴(kuò)增IL-37全長(zhǎng)編碼序列，構(gòu)建IL-37慢病毒表達(dá)載體：pLVX-IL-37-IRES-Green1。包裝并收集慢病毒，檢測(cè)慢病毒滴度及IL-37的表達(dá)。
　　5.構(gòu)建小鼠CIA模型，利用純化的IL-37蛋白和收集到的慢病毒研究IL-37對(duì)小鼠關(guān)節(jié)炎的影響。
　　結(jié)果：
　　1.提取人皮膚

5、總 RNA，通過(guò) RT-PCR擴(kuò)增出 IL-37基因序列，IL-37的序列全長(zhǎng)為657 bp，成功構(gòu)建了IL-37真核表達(dá)載體和原核表達(dá)載體。
　　2.成功表達(dá)出 IL-37蛋白，經(jīng)過(guò)親和層析純化并去除內(nèi)毒素，獲得了高純的IL-37蛋白；通過(guò)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)重組 IL-37蛋白具有抑制細(xì)胞釋放炎癥細(xì)胞因子的作用，證明純化的IL-37蛋白質(zhì)具有生物學(xué)活性。
　　3.成功構(gòu)建出 IL-37慢病毒表達(dá)載體，并包裝獲得了高滴度的病毒上

6、清，所包裝病毒上清具有感染力，在真核細(xì)胞中可以表達(dá)IL-37。
　　4.成功復(fù)制了膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎模型，通過(guò)腹腔注射重組 IL-37蛋白以及尾靜脈注射病毒上清，發(fā)現(xiàn)IL-37具有減輕小鼠關(guān)節(jié)炎癥的作用。
　　結(jié)論：
　　成功構(gòu)建了IL-37真核、原核表達(dá)載體和慢病毒載體；并且通過(guò)親和層析純化出IL-37蛋白質(zhì)。通過(guò)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證明獲得的重組IL-37蛋白具有較好的生物學(xué)活性，IL-37慢病毒上清能夠感染真核細(xì)胞并且表達(dá) I