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文檔簡介
1、目的:樹突狀細(xì)胞(dendritic cells, DCs)能高效地攝取、加工處理和遞呈抗原,處于啟動、調(diào)控和維持免疫應(yīng)答的中心環(huán)節(jié)。它的抗腫瘤特性是近幾年來國際上的研究熱點。腫瘤微環(huán)境是腫瘤細(xì)胞增殖和 DC行使功能的重要場所。本課題組以前綜合研究了腫瘤微環(huán)境中血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)、轉(zhuǎn)化生長因子-β1(transformed growth factor, T
2、GF-β1)和白介素-10(interleukin-10, IL-10)等多種細(xì)胞因子對DCs的生物物理特性和運(yùn)動能力的影響,尚未對單一細(xì)胞因子的作用進(jìn)行研究。為了更深入地理解DCs的生物學(xué)行為和腫瘤的免疫逃逸機(jī)制,本研究從生物物理學(xué)與免疫學(xué)交叉的角度出發(fā),探索VEGF對成熟DCs(mature dendritic cells, mDCs)生物物理特性的影響及其潛在的分子機(jī)制。
方法:本研究中,第一部分分別用10 ng/ml、
3、30 ng/ml、50 ng/ml和70 ng/ml的VEGF處理mDCs作為實驗組,未處理組作為對照。檢測了mDCs的細(xì)胞電泳率、滲透脆性和粘彈性等生物物理學(xué)指標(biāo),以及細(xì)胞骨架F-actin的形態(tài)及表達(dá)量、細(xì)胞核的形態(tài)和大小,部分細(xì)胞骨架結(jié)合蛋白的結(jié)構(gòu)及表達(dá)水平、跨人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(humen umbilical vein vascular endothelial cells, HUVECs)遷移能力和細(xì)胞的早晚期凋亡,從宏觀生物物理
4、學(xué)角度闡示了VEGF對mDCs的影響。第二部分用基因芯片、RT-PCR、傅里葉紅外光譜及蛋白質(zhì)印跡等分子生物學(xué)技術(shù)從基因和蛋白質(zhì)水平上深入探討了VEGF對mDC影響的機(jī)制。
結(jié)果:與對照組相比,細(xì)胞電泳率和滲透脆性在30 ng/ml(P<0.05)和50 ng/ml(P<0.01)均減?。辉?0 ng/ml時,mDCs的滲透脆性、粘彈性以及細(xì)胞的遷移率出現(xiàn)了最低值(P<0.01);細(xì)胞骨架系統(tǒng)F-actin發(fā)生重組且表達(dá)量上調(diào)
5、(P<0.05);VEGF對mDC的凋亡無明顯影響。基因芯片表達(dá)譜的結(jié)果發(fā)現(xiàn):50 ng/ml的VEGF使8280個基因表達(dá)上調(diào),4205個基因表達(dá)下調(diào),分別涉及了細(xì)胞粘附、遷移、細(xì)胞骨架重組和免疫應(yīng)答等功能;RT-PCR驗證發(fā)現(xiàn):VEGF使mDCs中基因LIMK1、ARPC5、ITGB2、GSN、PDGFR、HSPB1和SDCBP下調(diào),而使mDCs中基因PIP5K1B、EIF2S3和PKC表達(dá)上調(diào),其中除ARPC5和PIP5K1B外均
6、與芯片結(jié)果一致;共聚焦顯微鏡顯示細(xì)胞骨架結(jié)合蛋白cofilin和P-cofilin在細(xì)胞中共定位,處理組P-cofilin/cofilin熒光強(qiáng)度顯著減少(P<0.01);傅里葉紅外光譜技術(shù)發(fā)現(xiàn)mDCs中部分蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)發(fā)生改變;蛋白質(zhì)印跡結(jié)果顯示骨架蛋白結(jié)合蛋白Fascin-1和profilin表達(dá)有下調(diào)趨勢,cofilin表達(dá)有上調(diào)趨勢,P-cofilin表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.05),骨架蛋白結(jié)合蛋白的調(diào)節(jié)蛋白 LIMK1的表達(dá)
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