不穩(wěn)定型心絞痛患者循環(huán)miR-146a-5p的臨床意義及其膽固醇代謝途徑的調(diào)節(jié)作用.pdf

1、本文主要從以下幾個(gè)部分展開論述：
　　第一部分 不穩(wěn)定型心絞痛患者循環(huán)miR-146a-5p的臨床意義
　　目的:觀察循環(huán)miR-146a-5p在不穩(wěn)定型心絞痛(UA)患者和健康志愿者血漿中表達(dá)變化情況。
　　方法:連續(xù)入選自2012年9月至2012年12月就診于唐山工人醫(yī)院心內(nèi)科的近3個(gè)月未經(jīng)他汀類藥物治療并行冠狀動(dòng)脈造影檢查證實(shí)的UA患者23名。另選擇28名年齡、性別、臨床主要危險(xiǎn)因素相匹配的并經(jīng)冠狀動(dòng)脈造影證實(shí)冠

2、脈正常的相對(duì)健康人群作為正常對(duì)照組。實(shí)時(shí)定量RT-PCR方法檢測(cè)各受試者血漿miR-146a-5p循環(huán)水平，并應(yīng)用受試者工作曲線（ROC曲線）分析血漿miR-146a-5p水平變化對(duì)UA的臨床診斷價(jià)值。
　　結(jié)果:UA組患者主要臨床特征，包括年齡、性別、吸煙、高血壓病史、血脂水平較健康對(duì)照組均無(wú)顯著差異（P＞0.05）。以miR-423-5p為內(nèi)參，應(yīng)用Taqman熒光實(shí)時(shí)定量RT-PCR方法分別檢測(cè)健康對(duì)照組和UA組受試者血漿m

3、iR-146a-5p循環(huán)水平，結(jié)果顯示UA組患者血漿miR-146a循環(huán)水平，較健康對(duì)照組顯著性下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.0001）。通過ROC曲線分析，UA組miR-146a-5p曲線下面積(AUC)為0.997(95％ CI，0.9886-1.005，P＜0.0001)，其高特異性和靈敏度度，提示miR-146a-5p循環(huán)水平對(duì)UA患者人群具有潛在的臨床診斷應(yīng)用價(jià)值。
　　結(jié)論:在本實(shí)驗(yàn)中，相對(duì)健康對(duì)照組，miR-146

4、a-5p在UA患者血漿中的循環(huán)水平顯著性下降，研究結(jié)果提示炎癥及免疫調(diào)節(jié)相關(guān)miR-146-5p參與了UA的病理過程。其對(duì)UA患者人群的診斷、預(yù)后評(píng)價(jià)方面具有潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值。
　　第二部分 P.g-LPS、AGE-BSA上調(diào)PMA誘導(dǎo)THP-1巨噬細(xì)胞miRNA-146a基因表達(dá)
　　目的:既往大量研究證實(shí)，細(xì)菌脂多糖和晚期糖基化終末產(chǎn)物均能刺激單核巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)，成為觸發(fā)和促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)程的關(guān)鍵因子。同時(shí)，miR

5、NA-146a在細(xì)胞增殖、凋亡和分化所伴隨的炎癥反應(yīng)調(diào)控中扮演重要的角色。然而miRNA-146a是否參與細(xì)菌脂多糖和晚期糖基化終末產(chǎn)物誘導(dǎo)的THP-1源性巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)卻罕見報(bào)道。本研究的目的是觀察體外Pg-LPS(以下簡(jiǎn)稱LPS)和AGE-BSA刺激條件下，巨噬細(xì)胞miR-146a-5p表達(dá)水平變化情況。
　　方法:將不同孔細(xì)胞隨機(jī)分為轉(zhuǎn)染對(duì)照組，LPS組，AGE組和miR-146a-5p轉(zhuǎn)染組。LPS與AGE組分別在加入相

6、應(yīng)濃度LPS（1μg/mL）和AGE-BSA(100μg/mL)，刺激PMA誘導(dǎo)的THP-1巨噬細(xì)胞。應(yīng)用熒光實(shí)時(shí)定量RT-PCR方法檢測(cè)各組miR-146a-5p表達(dá)水平。
　　結(jié)果:以miR-146a-5p轉(zhuǎn)染組為陽(yáng)性對(duì)照，以轉(zhuǎn)染對(duì)照組為陰性對(duì)照，LPS、AGE-BSA刺激PMA誘導(dǎo)的THP-1巨噬細(xì)胞24 h后，miR-146a-5p表達(dá)水平均被顯著顯著性上調(diào)，分別升高了約9倍(P＜0.01)和2.3倍(P＜0.05)，差異

7、有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論:內(nèi)源性致炎性因子AGEs和外源性致炎性因子LPS均能上調(diào)PMA誘導(dǎo)的THP-1巨噬細(xì)胞miR-146a-5p的表達(dá)，提示miR-146a-5p在體內(nèi)外致炎性因子的抗炎性反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用。
　　第三部分 miRNA-146a-5p負(fù)向調(diào)控LPS和AGE誘導(dǎo)的THP-1巨噬細(xì)胞ABCA1、ABCG1蛋白水平變化
　　目的:膽固醇代謝途徑關(guān)鍵蛋白ABCA1和ABCG1在不穩(wěn)定型心絞痛的病理進(jìn)

8、程中發(fā)揮著重要作用。而UA動(dòng)脈粥樣硬化性病灶的慢性炎癥反應(yīng)與膽固醇代謝調(diào)節(jié)途徑的具體作用機(jī)制尚不明確。大量研究證實(shí)miRNA-146a在細(xì)胞增殖、凋亡和分化所伴隨的炎癥反應(yīng)調(diào)控中扮演重要的角色。然而miRNA-146a是否能夠調(diào)控由LPS和AGE-BSA誘導(dǎo)的ABCA1/ABCG1蛋白表達(dá)尚不清楚。本研究旨在是觀察LPS、AGE-BSA及miR-146a-5p對(duì)THP-1巨噬細(xì)胞ABCA1和ABCG1蛋白表達(dá)變化的影響作用。
　　

9、方法:將不同孔細(xì)胞隨機(jī)分為轉(zhuǎn)染對(duì)照組，LPS組，AGE組，miR-146a-5p轉(zhuǎn)染組，LPS+miR-146a組和AGE組+miR-146a組。含有LPS與AGE-BSA組于miR-146a-5p轉(zhuǎn)染24 h后分別加入相應(yīng)濃度LPS(1μg/mL)和AGE(100μg/mL)，再持續(xù)刺激6h，采用Western blotting免疫印跡法檢測(cè)各組ABCA1和ABCG1蛋白表達(dá)水平。
　　結(jié)果:同對(duì)照組相比，miR-146a-5p

10、單獨(dú)轉(zhuǎn)染組PMA誘導(dǎo)的THP-1巨噬細(xì)胞ABCA1、ABCG1蛋白水平無(wú)明顯變化(P＞0.05);而LPS組ABCA1、ABCG1蛋白表達(dá)水平均被顯著性上調(diào)(P＜0.05);AGE-BSA組ABCA1、ABCG1蛋白表達(dá)水平均被顯著性下調(diào)(P＜0.05)。與LPS組相比較，LPS+miR-146a共刺激組ABCA1和ABCG1蛋白水平被顯著性下調(diào)(P＜0.05);而與AGE-BSA組相比較，AGE-miR-146a共刺激組ABCA1和A

11、BCG1蛋白水平均被顯著性上調(diào)(P＜0.05)。
　　結(jié)論:內(nèi)源性致炎性因子AGEs和外源性致炎性因子P.g-LPS均能影響巨噬細(xì)胞膽固醇代謝關(guān)鍵調(diào)節(jié)蛋白ABCA1和ABCG1的基因表達(dá)，但其作用截然相反;在非致炎性條件下，miR-146a-5p對(duì)巨噬細(xì)胞ABCA1和ABCG1均無(wú)作用，然而體外模擬增加miR-146a-5p水平能夠逆轉(zhuǎn)致炎性因子所誘導(dǎo)的ABCA1和ABCG1基因表達(dá)變化。為研究miRNA、炎性反應(yīng)、膽固醇代謝途徑

12、間的交互作用研究，提供了新的科學(xué)依據(jù)和思路。
　　第四部分 miR-146a-5p通過靶向抑制IRAK-1調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞ABCA1、ABCG1表達(dá)
　　目的:從上述實(shí)驗(yàn)中我們觀察到LPS、AGE能夠誘導(dǎo)THP-1源性巨噬細(xì)胞ABCA1、ABCG1蛋白表達(dá)水平變化，且miRNA-146a可以逆轉(zhuǎn)該作用，但其可能機(jī)制尚未明確。本研究目的是觀察LPS，AGE-BSA和miRNA-146a對(duì)炎性調(diào)節(jié)因子IRAK-1和膽固醇代謝關(guān)鍵調(diào)控

13、因子LXRα/β蛋白表達(dá)水平的影響。
　　方法:將不同孔細(xì)胞隨機(jī)分為轉(zhuǎn)染對(duì)照組，LPS組，AGE組，miR-146a-5p轉(zhuǎn)染組，LPS+miR-146a組和AGE組+miR-146a組。含有LPS與AGE-BSA組于miR-146a-5p轉(zhuǎn)染24 h后分別加入相應(yīng)濃度LPS(1μg/mL)和AGE(100μg/mL)，再持續(xù)刺激6h，采用Western blotting免疫印跡法檢測(cè)各組IRAK-1和LXRα/β蛋白表達(dá)水平。<

14、br>　　結(jié)果:與轉(zhuǎn)染對(duì)照組相比較，單純miR-146a-5p轉(zhuǎn)染組IRAK-1蛋白水平顯著性降低（0.44±0.05 vs0.72±0.21，P＜0.05）;同對(duì)照組（0.72±0.21）相比，LPS組IRAK-1蛋白表達(dá)水平（1.04±0.24）顯著性升高(P＜0.05);而LPS+miR-146a共刺激組（0.66±0.24）較LPS組IRAK-1蛋白水平被顯著性降低（P＜0.05）。同對(duì)照組相比，AGE-BSA組IRAK-1蛋白

15、表達(dá)水平被顯著性升高(0.61±0.09 vs0.49±0.02，P＜0.05);同AGE-BSA組比較發(fā)現(xiàn)，AGE-B SA+miR-146a共刺激組IRAK-1水平被顯著性減低(0.38±0.08 vs0.61±0.09，P＜0.01)。與對(duì)照組相比較，LPS和AGE-BSA組巨噬細(xì)胞LXRα/β蛋白表達(dá)水平均無(wú)顯著性變化（P＞0.05）。
　　結(jié)論:在LPS或AGEs介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞ABCA1和ABCG1上調(diào)或下調(diào)作用中，IR

16、AK-1的蛋白水平均被顯著性升高;體外模擬增加細(xì)胞內(nèi)miR-146a-5p水平后，抑制了LPS或AGEs介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞IRAK-1的上調(diào)作用，說明miR-146a-5p能夠靶向抑制LPS或AGEs介導(dǎo)的IRAK-1的上調(diào)作用。深入研究發(fā)現(xiàn)，miR-146a不僅靶向抑制了炎性因子誘導(dǎo)的IRAK-1的上調(diào)作用，同時(shí)也逆轉(zhuǎn)了LPS或AGEs刺激條件下ABCA1和ABCG1的異常改變，提示miR-146a-5p可以通過負(fù)向調(diào)控靶基因IRAK-1