基于痰瘀毒病機(jī)所組旋覆歸連方抑制食管癌細(xì)胞生長機(jī)制的研究.pdf

1、　　目的：
　　基于中藥復(fù)方旋覆歸連方體外抑制人食管癌 ECa9706 細(xì)胞株生長的情況,探討旋覆歸連方的作用機(jī)制。
　　方法：
　　對旋覆歸連方用不同濃度乙醇冷浸法醇提提?。挥肕TT法檢測旋覆歸連方對食管癌細(xì)胞株的生長抑制作用,依據(jù)抑制率篩選最佳乙醇濃度：運(yùn)用高效液相法分析旋覆歸連方的藥物成分；Pearson Correlation法做抑制率和成分峰面積的相關(guān)分析；運(yùn)用偏最小二乘法(PLS)對抑制率和成分峰面積

2、做多元回歸分析；應(yīng)用昂立公司Affymetrix Human Genome U219 array Strip 芯片檢測基因表達(dá),差異基因篩選應(yīng)用倍數(shù)檢驗；應(yīng)用DAVID 2008 Functional Annotation Bioinforma和KEGG Tools(KEGG PATHWAY Database)在線分析上下調(diào)基因本體功能和信號通路；采用流式細(xì)胞儀技術(shù)檢測旋覆歸連方對食管癌細(xì)胞株 ECa9706 細(xì)胞周期和凋亡的影響。 <

3、br>　　結(jié)果：
　　1. 旋覆歸連方醇提最佳乙醇濃度為85%,以抑制率為觀察指標(biāo)對七種提取物進(jìn)行的層級聚類結(jié)果顯示：無水乙醇、95%乙醇最為接近和85%乙醇提取物歸為一類,應(yīng)用概率法95%置信區(qū)間85%乙醇提取物IC50值為58.11μg/mL。
　　2. MTT法顯示旋覆歸連方不同濃度作用于人食管癌ECa9706細(xì)胞48h后,與陰性對照組相比,均能使細(xì)胞株OD值降低,抑制率隨濃度增高而增高；選用濃度為15μg/mL、

4、25μg/mL和60μg/mL作用于人食管癌ECa9706細(xì)胞24h、48h、72h和96h后, OD值均比陰性對照組有不同程度的降低,抑制率呈劑量、時間依賴性。
　　3.高效液相法分析旋覆歸連方不同濃度乙醇提取物的藥物成分得到 22 個穩(wěn)定峰,峰面積和抑制率做 Pearson Correlation相關(guān)分析發(fā)現(xiàn) 10個峰與藥物抑制率呈顯著相關(guān)(p<0.05),根據(jù)對照品確定了小檗堿和阿魏酸兩個成分。偏小二乘法分析10個峰峰面積

5、與抑制率的關(guān)系,并建立了良好的多元回歸模型。
　　4.對藥物組和對照組的基因進(jìn)行倍數(shù)檢驗,滿足條件的差異基因有1294個,其中下調(diào)基因有 938 個,上調(diào)基因有 356 個。下調(diào)基因的本體功能分析中,主要與細(xì)胞周期、細(xì)胞增殖、泛素和RNA剪接等有關(guān)；上調(diào)基因本體功能分析中,主要與細(xì)胞凋亡、細(xì)胞應(yīng)答、轉(zhuǎn)錄及 DNA損傷等有關(guān)。下調(diào)基因信號通路中主要與細(xì)胞周期、腫瘤信號通路和胰島素信號通路等有關(guān)；上調(diào)基因信號通路中,主要與剪接體和N

6、orth信號通路等有關(guān)。
　　5.流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期結(jié)果顯示：旋覆歸連方作用于 ECa9706 細(xì)胞 48h 后與陰性對照組比較均能使 G0/G1期細(xì)胞顯著增多(p<0.05),使S、G2/M期細(xì)胞較陰性對照組顯著減少(p<0.05),G0/G1期細(xì)胞數(shù)量隨作用濃度升高而增加；檢測細(xì)胞凋亡結(jié)果顯示：旋覆歸連方作用于 ECa9706 細(xì)胞 48h、能明顯誘導(dǎo)食管癌細(xì)胞凋亡(p<0.05),以 60μg/mL 濃度組的作用效果最

7、佳,其次為25μg/mL濃度組和15μg/mL濃度組。
　　結(jié)論：
　　1.旋覆歸連方 85%乙醇冷浸法提取工藝簡便易行,所得提取物對食管癌細(xì)胞的抑制作用比較穩(wěn)定。
　　2. 旋覆歸連方能抑制人食管癌 ECa9706 細(xì)胞的體外增殖,其抑制作用呈劑量-時間-效應(yīng)關(guān)系,并能顯著影響人食管癌ECa9706細(xì)胞的形態(tài)。
　　3. 高效液相法分析旋覆歸連方成分,PLS 建立了峰面積和抑制率的多元回歸模型,初步探討

8、了該方成分與抑制率之間的關(guān)系,為進(jìn)一步研究該方提供依據(jù)。
　　4.應(yīng)用基因表達(dá)譜芯片檢測并篩選差異基因,發(fā)現(xiàn)該方能夠下調(diào) Cdc25A、CDK4和E2F1等細(xì)胞周期相關(guān)基因、上調(diào)RPS27L等細(xì)胞凋亡基因在食管癌ECa9706細(xì)胞中的表達(dá),通過多靶點(diǎn)多通路抑制食管癌細(xì)胞的生長,誘導(dǎo)食管癌細(xì)胞的凋亡。
　　5.旋覆歸連方對ECa9706細(xì)胞周期各時相均有影響,主要將ECa9706細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期,且有顯著的濃度依