IL-9及CD39在惡性腫瘤生長中的作用機制研究.pdf

1、腫瘤(tumor，neoplasm)是一類常見病、多發(fā)病，其中惡性腫瘤是目前危害人類健康最嚴重的一類疾病。隨著手術(shù)、化療、放療等治療方法的進步，許多惡性腫瘤患者的長期存活率有所提高，但部分患者仍不能免于復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移。
　　 侵襲性非霍奇金淋巴瘤(NHL)是一組淋巴組織異質(zhì)性疾病，目前很多類型尚不能治愈。B細胞NHL占惡性淋巴瘤的90％以上，全世界每年約有4％的新診斷病人。濾泡性淋巴瘤和彌漫性大B細胞淋巴瘤為NHL最常見的病理類型，

2、占50％以上。黑色素瘤(melanoma)是一種惡性程度相當高的惡性腫瘤，大多原發(fā)于皮膚，也可起源于眼、鼻腔等處，早期可發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移。與其他皮膚腫瘤相比，黑色素瘤的發(fā)病率并不高，但是由于其惡性程度高，引起的死亡率占皮膚相關(guān)腫瘤的75％。越來越多的證據(jù)顯示腫瘤微環(huán)境在腫瘤發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用，不僅決定腫瘤的惡性程度，還會影響治療效果。
　　 調(diào)節(jié)性T細胞(Treg)是機體維持自身耐受的重要組成部分，它廣泛參與自身免疫耐受、腫瘤免

3、疫、移植免疫等。Foxp3+Treg細胞是Treg細胞的重要亞群，能夠分泌IL-10、TGF-β、細胞毒性T淋巴細胞抗原4(CTLA-4)等多種分子，對效應(yīng)性T細胞具有抑制作用，與腫瘤的免疫抑制、免疫逃逸有密切關(guān)系。肥大細胞(MC)不僅是一種重要的免疫細胞，還可以發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。研究發(fā)現(xiàn)MC與人類腫瘤的發(fā)生具有一定的關(guān)系。許多研究證實腫瘤局部浸潤的MC數(shù)量與腫瘤的侵襲性(分級)和遠處轉(zhuǎn)移(分期)相關(guān)，提示MC在腫瘤生長中的重要作用。I

4、L-9是MC聚集和發(fā)揮效應(yīng)極其重要的免疫調(diào)節(jié)因子。國外的研究發(fā)現(xiàn)，在皮膚移植模型中，Treg細胞通過分泌IL-9征募和活化MC。最近的研究證實，在腎毒性血清腎炎模型中，Treg細胞與MC在抑制內(nèi)源性炎性疾病中同樣發(fā)揮重要作用，Treg細胞的抗炎作用依賴于IL-9介導(dǎo)的MC向腎臟引流淋巴結(jié)的浸潤。然而，Treg細胞、MC與IL-9間的復(fù)雜關(guān)系是否存在于腫瘤的免疫耐受過程中仍需進一步研究。
　　 三磷酸腺苷(ATP)參與體內(nèi)多種生理

5、過程，在機體細胞代謝，尤其是能量代謝過程中發(fā)揮極其重要的作用。胞外ATP通過作用于嘌呤P2受體，產(chǎn)生一系列下游信號。許多細胞存在ATP的基礎(chǔ)釋放，釋放和水解達到平衡，使胞外ATP穩(wěn)定在10nM水平。細胞內(nèi)ATP的濃度為3-10mM，胞內(nèi)外濃度差的維持是通過胞外核酸酶來實現(xiàn)的，它們通過水解細胞釋放的ATP，依次生成二磷酸腺苷(ADP)和單磷酸腺苷(AMP)，進一步生成腺苷。這些核酸酶維持著細胞內(nèi)外ATP的濃度梯度。所以，細胞內(nèi)ATP的少量

6、釋放即可引起胞外ATP濃度的顯著增加，從而影響嘌呤信號通路。
　　 化學(xué)治療直接引起腫瘤細胞的死亡，腫瘤細胞在死亡過程中釋放大量胞內(nèi)介質(zhì)，包括ATP。近來，ATP已經(jīng)被證實是腫瘤細胞死亡后釋放的一種新的危險信號，免疫細胞同樣也可以釋放ATP，在腫瘤免疫治療中發(fā)揮極其重要的作用。惡性程度高、生長迅速的腫瘤，比如黑色素瘤，腫瘤組織中央由于缺血缺氧經(jīng)常發(fā)生細胞壞死，壞死細胞即可釋放大量ATP。
　　 CD39/ENTPD1(二

7、三磷酸核苷酸水解酶-1)，是表達在內(nèi)皮細胞和Treg細胞表面的主要的核苷酸水解酶。ATP釋放入腫瘤局部胞外微環(huán)境后立即被CD39迅速代謝為AMP。所以，在Cd39基因敲除(KO)小鼠中，生長迅速的腫瘤組織中央壞死的腫瘤細胞釋放的大量ATP不能被迅速清除，就可能會引起局部胞外ATP水平的急劇增高，從而引起相鄰腫瘤細胞的死亡。因此，針對核苷酸水解酶CD39表達或活性的治療方法，或者與其他化療方案相結(jié)合的方法，可以為腫瘤的治療提供新的途徑。<

8、br>　　 本研究通過應(yīng)用分子生物學(xué)，細胞生物學(xué)及多種免疫學(xué)技術(shù)，進一步闡明IL-9和CD39在惡性腫瘤生長中的作用，探討免疫逃逸及嘌呤信號在腫瘤生長中的作用機制，尋求腫瘤免疫及生物治療的新方法，提高治療效果，改善患者預(yù)后。
　　 第一部分：IL-9在調(diào)節(jié)性T細胞和肥大細胞介導(dǎo)的B細胞非霍奇金淋巴瘤免疫耐受中的作用機制研究
　　 目的：非霍奇金淋巴瘤(NHL)是來源于B、T淋巴細胞的免疫系統(tǒng)惡性腫瘤，免疫系統(tǒng)功能紊亂與

9、淋巴瘤的發(fā)生有著密切的關(guān)系。調(diào)節(jié)性T細胞(Treg)和肥大細胞(MC)的局部浸潤在腫瘤免疫耐受過程中發(fā)揮重要作用。IL-9是MC聚集和發(fā)揮效應(yīng)極其重要的免疫調(diào)節(jié)因子。為了研究IL-9在Treg細胞和MC介導(dǎo)的B細胞NHL免疫耐受中的作用，收集病理診斷明確的B細胞NHL患者的腫瘤組織和反應(yīng)性增生的淋巴結(jié)，對Treg細胞、MC在腫瘤局部的浸潤及相關(guān)蛋白的表達情況進行分析，同時收集患者血清檢測IL-9水平，并與患者臨床特征、腫瘤標志物進行相關(guān)

10、性分析，探討它們在腫瘤發(fā)展過程中的作用。同時，建立了小鼠淋巴瘤模型，應(yīng)用抗體中和小鼠體內(nèi)IL-9之后，觀察腫瘤的生長情況及Treg細胞和MC相關(guān)基因的表達情況。為了進一步明確IL-9對Treg細胞功能和凋亡及MC分化和功能的影響，在體外分離培養(yǎng)Treg細胞，對進行功能和凋亡的檢測，另外，在培養(yǎng)中的小鼠骨髓細胞中加入IL-9，觀察骨髓來源的肥大細胞(BMMC)誘導(dǎo)情況及功能基因的表達情況。
　　 材料與方法：
　　 1.標

11、本收集;2.細胞培養(yǎng)與動物實驗;3.蛋白提取及蛋白印記分析;4.免疫組織化學(xué)(IHC);5.收集血清，進行ELISA分析;6.提取RNA，進行RT-PCR;7.BMMC的培養(yǎng);8.Treg細胞及效應(yīng)性T細胞(Teff)的分離;9.CD4+CD25+Treg細胞的培養(yǎng)及Teff細胞增殖的檢測;10.流式細胞儀分析;11.統(tǒng)計學(xué)分析結(jié)果。
　　 1.B細胞NHL患者腫瘤組織Foxp3、CD117的表達情況及血清IL-9水平：Foxp

12、3和CD117在B細胞NHL患者腫瘤組織中的表達均高于對照組。IHC結(jié)果顯示，在所有患者的組織切片中，均可發(fā)現(xiàn)Foxp3+Treg細胞和CD117+MC的浸潤，不同患者Foxp3+Treg細胞的分布不同，CD117+MC主要分布在淺表髓質(zhì)，尤其是小血管和小淋巴管周圍。與對照組相比，B細胞NHL患者腫瘤組織中浸潤的Foxp3+Treg細胞和CD117+MC均明顯增多。B細胞NHL患者外周血中IL-9檢測的陽性率明顯高于健康對照組。

13、　　 2.Foxp3+Treg細胞和CD117+MC的數(shù)量與患者臨床特征的相關(guān)性分析：Foxp3+Treg細胞的數(shù)量與患者的主要臨床特征無明顯相關(guān)性。CD117+MC的數(shù)量與患者的主要臨床特征也無明顯相關(guān)性。然而，與檢測不到IL-9的患者相比，可以檢測到IL-9的患者可以發(fā)現(xiàn)更多數(shù)量的MC，該差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 3.Foxp3+Treg細胞、CD117+MC的數(shù)量與B細胞NHL腫瘤指標的相關(guān)性分析：Foxp3+Treg細

14、胞與CD117+MC的數(shù)量呈明顯的正相關(guān)。而且，F(xiàn)oxp3+Treg細胞、CD117+MC的數(shù)量與B細胞NHL患者外周血LDH、β2-MG濃度也具有明顯的正相關(guān)。
　　 4.小鼠體內(nèi)IL-9的中和明顯延緩腫瘤的生長：正常小鼠與淋巴瘤小鼠外周血中IL-9檢測結(jié)果顯示，IL-9的水平在荷瘤鼠中明顯增高。應(yīng)用抗小鼠IL-9抗體治療后，腫瘤的生長明顯延緩。該現(xiàn)象提示IL-9在腫瘤的生長過程中具有極其重要的作用。
　　 5.小鼠腫

15、瘤引流淋巴結(jié)內(nèi)Treg細胞和MC相關(guān)基因的表達情況：檢測了腫瘤引流淋巴結(jié)內(nèi)Treg細胞和MC相關(guān)基因的表達情況，包括Foxp3，干細胞受體(CD117)，高親和力的IgE受體(Fcerlα)，MC蛋白酶1(Mcptl)和MC蛋白酶5(Mcpt5)。與正常淋巴結(jié)相比，各基因在對照組的表達均明顯增高，IL-9的中和明顯下調(diào)這些基因的表達。
　　 6.體外活化的Treg細胞產(chǎn)生高水平的IL-9，IL-9可以影響Treg細胞的功能和凋亡

16、：Treg細胞在體外被CD3抗體和CD28抗體活化后可以產(chǎn)生高水平的IL-9，而且IL-9的濃度隨著細胞培養(yǎng)時間的延長而升高。CD4+CD25+Treg細胞和CD4+CD25-Teff細胞進行共同培養(yǎng)，通過3H-胸腺嘧啶摻入率檢測來明確CD4+CD25-Teff細胞的增殖情況。發(fā)現(xiàn)IL-9(20ng/ml)的加入明顯抑制Teff細胞的增殖，相反，IL-9抗體(10μg/ml)中和培養(yǎng)基中活化的Treg細胞產(chǎn)生的IL-9可以逆轉(zhuǎn)Treg細

17、胞介導(dǎo)的增殖抑制作用。nTreg細胞培養(yǎng)在含或不含IL-9的無血清培養(yǎng)基中72小時后，收集細胞進行凋亡檢測。發(fā)現(xiàn)nTreg細胞在無血清培養(yǎng)基中很快凋亡，然而IL-9的加入減少了凋亡細胞的比例，明顯降低了壞死細胞的數(shù)量，說明IL-9可以作為nTreg細胞的凋亡抑制因子，IL-9抗體的加入可以明顯逆轉(zhuǎn)IL-9對nTreg的保護作用。
　　 7.IL-9對IL-3和SCF依賴的BMMC誘導(dǎo)分化及MC功能基因表達的影響：培養(yǎng)中的小鼠骨髓

18、細胞加入IL-9后，BMMC的純度在前三周明顯增高。這一現(xiàn)象與MC相關(guān)基因的表達增高一致，包括CD117、Fcerlα、Mcptl和Mcpt5。這些數(shù)據(jù)表明，IL-9是誘導(dǎo)BMMC分化成熟的重要細胞因子，可以誘導(dǎo)BMMC分化及功能基因的表達。
　　 結(jié)論：Foxp3+Treg細胞和CD117+MC在B細胞NHL患者腫瘤組織中的浸潤明顯增加，與患者腫瘤標志物濃度呈正相關(guān)，在腫瘤的生長過程中發(fā)揮重要作用；IL-9在B細胞NHL患者及

19、淋巴瘤小鼠外周血中明顯增高，并且促進腫瘤的生長；體外活化的Treg細胞可以產(chǎn)生大量的IL-9，IL-9不僅可以增強 Treg細胞的抑制作用，還可以抑制Treg細胞的凋亡；IL-9可以促進小鼠骨髓細胞向BMMC的分化，增強MC功能基因的表達。IL-9在Treg細胞和MC介導(dǎo)的免疫反應(yīng)中的重要作用提示，阻斷IL-9的信號通路或者抑制IL-9的活性可以作為阻斷Treg細胞和MC介導(dǎo)的免疫耐受的重要途徑。
　　 第二部分：內(nèi)皮細胞CD3

20、9/ENTPD1在腫瘤生長中的作用機制研究
　　 目的：三磷酸腺苷(ATP)參與體內(nèi)多種生理過程，胞外ATP通過作用于嘌呤P2受體，產(chǎn)生一系列下游信號。細胞內(nèi)外ATP濃度差的維持是通過胞外核酸酶來實現(xiàn)的，細胞內(nèi)ATP的少量釋放即可引起胞外ATP濃度的顯著增加，從而影響嘌呤信號通路。化學(xué)治療直接引起腫瘤細胞的死亡，腫瘤細胞在死亡過程中釋放大量胞內(nèi)介質(zhì)，包括ATP。CD39/ENTPD1(二三磷酸核苷酸水解酶-1)，是表達在內(nèi)皮細胞

21、和Treg細胞表面的主要的核苷酸水解酶。ATP釋放入腫瘤局部胞外微環(huán)境后立即被CD39迅速代謝為AMP。在本研究中，我們探討ATP在腫瘤細胞的增殖及死亡過程中的作用及其機制，進一步研究內(nèi)皮細胞表面表達的CD39在ATP介導(dǎo)的腫瘤抑制過程中的作用。
　　 材料與方法：
　　 1.實驗動物與細胞培養(yǎng)；2.Luc-B16/F10細胞體外增殖及活性檢測；3.肝血竇內(nèi)皮細胞(LSECs)的分離培養(yǎng)及純度檢測；4.P2受體拮抗劑或L

22、SEC與luc-B16/F10細胞共培養(yǎng)；5.蛋白質(zhì)提取與蛋白印記分析；6.RT-PCR和實時定量RT-PCR；7.流式細胞儀分析；8.腫瘤上清制備；9.ATP濃度的檢測；10.免疫組織化學(xué)染色和細胞免疫熒光染色；11.薄層層析；12.統(tǒng)計學(xué)分析結(jié)果。
　　 1.ATP的抗增殖作用是通過P2X7受體實現(xiàn)的ATP對luc-B16/F10細胞的增殖具有明顯抑制作用，且抑制程度與ATP具有濃度依賴關(guān)系。BzATP是一種化學(xué)合成的非水解

23、ATP類似物，與理論推測結(jié)果一致，它對黑色素瘤細胞增殖的抑制作用更明顯。ATP對結(jié)腸癌細胞株MCA38同樣具有明顯的增殖抑制作用。將幾種P2受體拮抗劑，包括KN-62(P2X7受體拮抗劑)、MRS-2500(P2Y1受體拮抗劑)和suramin(非選擇性P2受體拮抗劑)，與ATP(2.5mM)共同處理黑色素瘤細胞發(fā)現(xiàn)，KN-62可以明顯降低ATP引起的細胞增殖抑制作用，且呈濃度依賴關(guān)系。MRS-2500或suramin都不能阻斷ATP的

24、抑制作用。Westernblot結(jié)果明確了P2X7受體在luc-B16/F10細胞的表達。因此，P2X7受體介導(dǎo)了，至少部分參與了，ATP引起的細胞增殖抑制作用。
　　 2.ATP通過P2X7受體促進細胞死亡ATP對luc-B16/F10細胞也具有明顯的細胞毒作用。原位細胞分析表明，加入ATP之后，細胞死亡明顯增加，細胞克隆和細胞計數(shù)降低，且降低的程度與ATP呈濃度依賴關(guān)系。ATP對結(jié)腸癌細胞株MCA38同樣具有明顯的細胞毒作用

25、。ATP與KN-62、MRS-2500或suramin共同處理細胞后，用FITC-Annexin V和PI對細胞染色并進行流式分析。發(fā)現(xiàn)，ATP處理后，細胞凋亡與壞死同時存在，且呈時間依賴關(guān)系。而且，ATP引起的凋亡/壞死可以被P2X7受體拮抗劑KN-62阻斷，但不能被。MRS-2500或suramin阻斷。細胞凋亡相關(guān)蛋白caspase-3和caspase-9的表達情況證實，細胞中加入ATP后，其活化產(chǎn)物的表達隨著處理時間的延長明顯增

26、加。Western blot分析的結(jié)果也同樣驗證了這一現(xiàn)象。而且，ATP引起的活化caspase-3和caspase-9表達的增加也可以被KN-62阻斷。
　　 實時定量RT-PCR結(jié)果表明，ATP處理16小時后，luc-B16/F10細胞P2X7mRNA的表達明顯增加，然而，ATP引起的P2X7表達增高可以被KN-62抵消。這些現(xiàn)象表明，ATP引起的luc-B16/F10細胞死亡包括細胞凋亡和壞死，P2X7受體介導(dǎo)了，至少部分

27、參與了，ATP引起的細胞凋亡/壞死。
　　 3.Apyrase或LSECs表達的CD39可以抵消/逆轉(zhuǎn)ATP的抗腫瘤作用Apyrase可以完全中和ATP的抗腫瘤作用，且中和作用呈濃度依賴性。CD39和CD73是表達在LSECs上的主要的核苷酸酶。野生型(WT)LSECs可以明顯削弱ATP的抑制作用，而Cd39 KO LSECs不能中和ATP的作用。Cd73 KOLSECs對ATP的抑制作用更加明顯，且與LSECs細胞數(shù)量呈依賴性

28、。同時還發(fā)現(xiàn)，胞外ATP對LSECs的生長同樣具有抑制作用。薄層層析分析結(jié)果顯示ATP的水解產(chǎn)物ADP，被WT LSECs首先水解為AMP，然后是腺苷。Cd73 KO LSECs僅能水解ADP產(chǎn)生AMP，不能產(chǎn)生腺苷。與WT LSECs相比，Cd39 KO LSECs和luc-B16/F10細胞僅具有微弱的非特異性核酸酶活性。
　　 4.小鼠Cd39基因敲除引起腫瘤血管生成減少、中央壞死面積增大和P2X7表達增高損傷的腫瘤細胞可

29、以釋放一系列內(nèi)源性介質(zhì)，將制備的腫瘤上清加入到培養(yǎng)中的luc-B16/F10細胞，細胞增殖受到明顯抑制，且呈劑量依賴性。然而，apyrase并不能抵消腫瘤上清引起的細胞生長抑制作用。這些現(xiàn)象說明，腫瘤上清中除了ATP，還含有其他細胞毒物質(zhì)。對肝臟黑色素瘤組織切片進行CD31和CD39免疫組織化學(xué)染色，發(fā)現(xiàn)在WT小鼠，CD39表達在腫瘤相關(guān)內(nèi)皮細胞上，然而，Cd39 KO小鼠由于缺乏CD39的表達(說明腫瘤微環(huán)境中ATP降解減少)，血管生

30、成明顯減少，腫瘤中央壞死區(qū)明顯增大。腫瘤組織切片免疫熒光染色進一步表明，與WT小鼠相比，腫瘤細胞P2X7在Cd39 KO小鼠的表達明顯升高。結(jié)論：細胞外高濃度ATP對腫瘤細胞具有明顯的增殖抑制作用，且呈濃度依賴性，該作用是通過P2X7受體介導(dǎo)的；細胞外高濃度ATP還可以誘導(dǎo)腫瘤細胞的凋亡和壞死，該作用也是P2X7受體介導(dǎo)實現(xiàn)的；在體外，Apyrase或LSECs表達的CD39可以抵消/逆轉(zhuǎn)ATP的抗腫瘤作用；在體內(nèi)，CD39的促腫瘤作用