血管緊張素Ⅱ保護(hù)低糖低氧致神經(jīng)元損傷及機(jī)制探討.pdf

1、目的缺血性腦血管疾病(ischemia cerebral vascular disease,ICVD)是嚴(yán)重危害人類健康的一類疾病，是人類死亡的主要原因之一。腦缺血再灌注損傷在腦血管病發(fā)生發(fā)展過程中的作用日益引起人們的重視。在腦缺血損傷的病理研究中，人們對(duì)因缺血所致能量不足引起的進(jìn)行性細(xì)胞死亡，即壞死已有較深的認(rèn)識(shí)，而對(duì)細(xì)胞凋亡途徑認(rèn)識(shí)較晚?，F(xiàn)在大量的事實(shí)已經(jīng)證明在缺血性腦損傷中凋亡的存在，尤其在再灌注損傷中起重要的作用。血管緊張素Ⅱ是

2、腎素-血管緊張素系統(tǒng)(RAS)的重要生物活性物質(zhì)。它具有收縮血管、升高血壓、刺激腎上腺皮質(zhì)分泌醛固酮等功能。最近研究表明，血管緊張素Ⅱ還可以影響不同組織的凋亡情況。本實(shí)驗(yàn)的目的是從細(xì)胞及分子水平，通過體外培養(yǎng)大鼠皮層神經(jīng)元建立缺血缺氧損傷模型，觀察血管緊張素Ⅱ?qū)ι窠?jīng)元的保護(hù)作用并進(jìn)一步探討其機(jī)制。 方法：取新生24h內(nèi)wistar乳鼠，在超凈工作臺(tái)內(nèi)，無菌條件下進(jìn)行大鼠皮層神經(jīng)元原代培養(yǎng)。培養(yǎng)至第三天時(shí)，加入阿糖胞苷抑制非神經(jīng)元

3、細(xì)胞的生長進(jìn)行純化。作用48h后更換新鮮培養(yǎng)液。以后每隔兩天半量換液2次，培養(yǎng)至第7天時(shí)開始實(shí)驗(yàn)。將細(xì)胞隨機(jī)分組為：①正常對(duì)照組；②缺糖缺氧損傷組；③血管緊張素Ⅱ高(H)、中(M)、低(L)濃度組(1×10<'-6>mol/L、1×1 O<'-7>mol/L、1×10<'-8>mol/L)④血管緊張素Ⅱ(H)+PD123319(1×10<'-5>mol/L)組，⑤血管緊張素Ⅱ(H)+纈沙坦(1×10<'-5>mol/L)組。正常對(duì)照組常

4、規(guī)換液培養(yǎng)；損傷組棄去原培養(yǎng)液，D-Hank's液洗2次后，加入含1mmol/l的連二亞硫酸鈉的無糖Earle's液，置培養(yǎng)箱中37℃、5％CO<,2>、飽和濕度下培養(yǎng)1h后換以完全培養(yǎng)基，制造缺糖缺氧的損傷模型；藥物處理組在損傷過程中和損傷后先后分別加入含不同濃度藥物的無糖Earle’s液及完全培養(yǎng)基。再灌注損傷12h后倒置相差顯微鏡下進(jìn)行一般形態(tài)學(xué)觀察，MTT法測定各組細(xì)胞的存活率，AnnexinV-PI雙標(biāo)流式細(xì)胞術(shù)測定皮層神經(jīng)

5、元凋亡率，RT-PCR法檢測皮層神經(jīng)元凋亡相關(guān)基因bcl-2、bax mRNA表達(dá)水平。 結(jié) 果 缺糖缺氧再灌注組，細(xì)胞出現(xiàn)腫脹，胞體增大，失去折光性，成網(wǎng)的突起部分被破壞、斷裂。隨著損傷時(shí)間的延長，神經(jīng)元細(xì)胞出現(xiàn)明顯的腫脹，突起明顯回縮，部分突起雖然回縮不明顯，但突起失去原來自然順滑的外觀，變得僵硬屈曲，部分細(xì)胞脫壁漂浮于培養(yǎng)液中，胞體立體感差，折光度下降，可見大量細(xì)胞碎片。胞質(zhì)失去均質(zhì)外觀，出現(xiàn)許多黑色顆粒，部分區(qū)域可見有亮

6、斑形成。血管緊張素II1×10<'-8>mol/L濃度雖然可以改善神經(jīng)元原有形態(tài)，但改善的程度不如血管緊張素II1×10<'-7>moI/L和1×10<'-6>mol/L濃度，纈沙坦組及PD123319組均可以明顯改善神經(jīng)元的形態(tài)，多數(shù)細(xì)胞保持原來的形態(tài)學(xué)特征，神經(jīng)元腫脹不明顯，少數(shù)細(xì)胞可見突起縮短、斷裂。與正常組相比，缺糖缺氧再灌注損傷組細(xì)胞存活率顯著下降，血管緊張素II1×10<'-8>mol/L濃度雖然能提高受損神經(jīng)元的存活率，但

7、二者沒有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，而血管緊張素Iil×10<'-7>mol/L和1×10<'-6>mol/L則可以顯著提高神經(jīng)元存活率。PD123319組雖然能提高受損神經(jīng)元的存活率，但二者沒有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。纈沙坦組則可以明顯提高神經(jīng)元的存活率。同時(shí)血管緊張素II可呈濃度依賴性的降低神經(jīng)元的凋亡率，PDl233l9組和纈沙坦組雖然也可以顯著降低神經(jīng)元的凋亡率，但二者與高濃度血管緊張素Ⅱ組之間沒有顯著差異。此外，血管緊張素II可呈濃度依賴性的提高

8、bcl-2 mRNA的表達(dá)。PD123319組雖然可以提高bc1-2 mRNA的表達(dá)，但升高幅度顯著不如纈沙坦組，二者之間有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。對(duì)于bax mRNA的表達(dá)，與正常組相比，損傷組bax mRNA的表達(dá)水平較正常組顯著增加，血管緊張素II可降低baX mRNA的表達(dá)，PD123319組雖然可以降低損傷神經(jīng)元bax mRNA的表達(dá)，但降低幅度顯著不如纈沙坦組，二者之間有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 結(jié)論血管緊張素Ⅱ能保護(hù)缺