神經(jīng)生長因子和膠原蛋白的LIF-CE分析方法研究及應(yīng)用.pdf

1、目的：為了進(jìn)一步研究神經(jīng)損傷修復(fù)的機(jī)制及探索肌腱組織工程研究中支架材料和種子細(xì)胞的變化情況，選擇兩種蛋白質(zhì)-神經(jīng)生長因子(Nerve growth factor，NGF)和膠原蛋白(Collagen)，將衛(wèi)生檢驗(yàn)中的高新技術(shù)與生化和臨床醫(yī)學(xué)理論研究相結(jié)合，建立激光誘導(dǎo)熒光檢測-毛細(xì)管電泳分析這兩種蛋白質(zhì)的方法，為指導(dǎo)臨床采用神經(jīng)生長因子治療疾病和尋求組織工程技術(shù)治療肌腱缺失的最佳條件，提供快速、靈敏的分析手段和可靠的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

2、方法：考察了影響上述兩種蛋白質(zhì)測定的各種因素，分別進(jìn)行了如下工作： 1．NGF的純化 采用十二烷基硫酸鈉．聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離純化了大鼠脊髓中的NGF，利用反相高效液相色譜(RP-HPLC)檢測產(chǎn)品的純度，Western雜交法檢驗(yàn)其免疫活性。為建立神經(jīng)生長因子的毛細(xì)管電泳免疫分析方法提供高純度的NGF(抗原)。 2．激光誘導(dǎo)熒光檢測．毛細(xì)管電泳免疫分析NGF 大鼠脊髓樣品中的NGF經(jīng)磷酸鹽溶解及

3、真空冷凍干燥濃縮后，與異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的NGF單克隆抗體發(fā)生抗原抗體的特異性結(jié)合反應(yīng)，經(jīng)毛細(xì)管區(qū)帶電泳分離復(fù)合物、游離抗體和游離的FITC，測定了大鼠脊髓損傷前后NGF含量的變化，并與傳統(tǒng)的Western雜交法進(jìn)行了比較。 3．激光誘導(dǎo)熒光檢測-毛細(xì)管區(qū)帶電泳分析羥脯氨酸組織化工程肌腱和新生小雞屈趾肌腱細(xì)胞中的膠原蛋白經(jīng)堿水解后生成氨基酸。經(jīng)FITC衍生，采用激光誘導(dǎo)熒光檢測．毛細(xì)管電泳分離測定膠原蛋白特異性氨基酸

4、-羥脯氨酸，利用羥脯氨酸的測得值計(jì)算膠原蛋白的含量，并比較了不同植入時(shí)間的肌腱和不同培養(yǎng)方式的細(xì)胞中膠原蛋白含量的變化。 結(jié)果：1．對(duì)SDS-PAGE純化大鼠脊髓樣品中蛋白質(zhì)的條件進(jìn)行了優(yōu)化，分離純化其中的NGF并測定其分子量為16kD，經(jīng)Western雜交證明具有與NGF單克隆抗體的免疫特異性，HPLC檢測NGF純度為99.2％。 2．優(yōu)化了NGF抗體的FITC標(biāo)記條件，研究了NGF與其標(biāo)記抗體的結(jié)合反應(yīng)及其反應(yīng)產(chǎn)物的

5、毛細(xì)管電泳分離條件。建立了NGF的激光誘導(dǎo)熒光檢測-毛細(xì)管電泳免疫分析測定方法。NGF在0.3ng/ml-30ng/ml濃度范圍內(nèi)線性良好，檢出限為0.3ng／ml。相對(duì)遷移率和相對(duì)峰高的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為3.70％和2.46％。并對(duì)損傷前后的脊髓樣品進(jìn)行了測定，并與傳統(tǒng)免疫方法Western雜交進(jìn)行了比較，兩者測定結(jié)果均顯示脊髓損傷7天后，脊髓中NGF含量增加三倍多，測得值的相對(duì)誤差為-12.4％～4.3％。 3．優(yōu)化了組織化

6、工程肌腱和新生小雞屈趾肌腱細(xì)胞樣品水解、FITC標(biāo)記氨基酸和毛細(xì)管電泳分離羥脯氨酸的條件，建立了測定羥脯氨酸的激光誘導(dǎo)熒光檢測-毛細(xì)管區(qū)帶電泳分析方法，再以羥脯氨酸的含量計(jì)算樣品中膠原蛋白的含量。羥脯氨酸在0.5ng/ml～8ug/ml濃度范圍內(nèi)線性良好，檢出限為0.5ng/ml。相對(duì)遷移率和相對(duì)峰高的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為5.0％和6.1％，加標(biāo)回收率在95％～110％。對(duì)60份肌腱樣品和9份細(xì)胞樣品進(jìn)行了測定，考察組織化工程肌腱植入后在

7、體內(nèi)的降解情況及體外靜態(tài)(動(dòng)態(tài))培養(yǎng)后肌腱細(xì)胞生長和分泌活性的改變，同時(shí)建立了HPLC測定羥脯氨酸的方法，并將所建立的毛細(xì)管電泳方法與HPLC法進(jìn)行比較，相對(duì)誤差為-1.9％-2.0％。 結(jié)論：1．建立了SDS-PAGE純化NGF的方法，較傳統(tǒng)的兩次色譜更為簡單快速，利用超聲波振蕩提取，提高了提取效率。經(jīng)Western雜交和HPLC檢測，確定其免疫活性和純度，可以用作毛細(xì)管電泳免疫分析方法中的NGF抗原。 2．建立了測定

8、NGF的激光誘導(dǎo)熒光檢測．毛細(xì)管電泳免疫分析法，與傳統(tǒng)Western雜交方法比較，本法所需樣品量和試劑用量少，分離效能高，分析周期短，10min內(nèi)可完成一個(gè)分析周期，目前在國內(nèi)外尚未見相關(guān)的研究報(bào)道。該法適用于研究脊髓損傷前后NGF含量的變化，測定結(jié)果與傳統(tǒng)方法Western雜交基本一致。 3．建立了羥脯氨酸的激光誘導(dǎo)熒光檢測．毛細(xì)管區(qū)帶電泳分析方法，該方法僅需一次熒光標(biāo)記，操作簡單，快速靈敏，適于測定肌腱和細(xì)胞樣品，在12mi

9、n內(nèi)完成一個(gè)分析周期，本法與HPLC法比較，兩方法測定結(jié)果相對(duì)誤差小于10％。目前國內(nèi)尚未見相關(guān)報(bào)道，國外有少量關(guān)于毛細(xì)管電泳分離測定羥脯氨酸的報(bào)道，均是通過兩次熒光衍生后，采用毛細(xì)管膠束電動(dòng)模式分離分析，樣品為尿樣和肌肉。用本法測定了60份組織化工程肌腱樣品，植入前肌腱膠原蛋白含量均值為95.5％，植入一周后為90.7％，三周后為88.2％，五周后為85.1％，八周后為80.8％，即隨植入時(shí)間延長，膠原蛋白含量有所下降，提示該組織化工

10、程肌腱可能作為組織工程研究中的支架材料。測定了9份生物支架上的肌腱細(xì)胞樣品，靜態(tài)構(gòu)建的肌腱細(xì)胞分泌的膠原含量23.3％；動(dòng)態(tài)構(gòu)建的細(xì)胞為53.5％。實(shí)驗(yàn)結(jié)果與肌腱細(xì)胞計(jì)數(shù)一致。 本研究為神經(jīng)生長因子和羥脯氨酸的檢測提供了一種新型、靈敏和快速的分析方法。為進(jìn)一步了解體內(nèi)NGF的含量及其變化規(guī)律，指導(dǎo)外源性NGF的應(yīng)用，為肌腱組織工程學(xué)研究中探索合適的生物支架及細(xì)胞培養(yǎng)等研究提供可靠的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和科學(xué)依據(jù)。 本課題研究得到了