體外研究銀屑病患者骨髓造血細胞活性.pdf

1、背景：銀屑病是由多種原因所致的慢性炎癥性皮膚病，T細胞已被認為是促發(fā)銀屑病細胞與分子生物學(xué)炎性網(wǎng)絡(luò)并最終導(dǎo)致皮損形成的重要因素。臨床研究發(fā)現(xiàn)銀屑病皮損T細胞浸潤明顯，應(yīng)用免疫抑制劑阻斷或抑制T細胞活性后可取得取得治療效果，顯示皮損或外周血T細胞均可促進角質(zhì)形成細胞增殖，而銀屑病T細胞皮下注射于人皮膚-SCID鼠嵌合體誘發(fā)銀屑病皮損的動物實驗則為體現(xiàn)T細胞在銀屑病發(fā)病中重要作用的更直接的證據(jù)。日益增多的證據(jù)表明，銀屑病是一多種致病基因協(xié)同

2、作用且具有極強遺傳傾向的皮膚病，單卵雙生子同患率高達60％。雖然多種因素均可激活免疫系統(tǒng)導(dǎo)致病理性T細胞的產(chǎn)生，但強烈且復(fù)雜的遺傳背景提示內(nèi)源性因素在銀屑病發(fā)病中發(fā)揮極其重要的作用。此外，在銀屑病的整個發(fā)病過程中不僅僅是T細胞活性和數(shù)量的改變，還涉及其它免疫細胞，如銀屑病患者體內(nèi)B淋巴細胞、單核細胞、中性粒細胞及自然殺傷細胞等眾多免疫細胞甚至紅細胞及血小板均存在數(shù)量及功能的異常。由于所有免疫細胞均源自骨髓造血細胞，結(jié)合骨髓移植可消增銀屑

3、病的報道，故有理由認為銀屑病患者免疫異?？赡芘c由骨髓造血細胞活性有關(guān)。 目的： 1.檢測銀屑病患者骨髓造血細胞高增殖潛能集落形成細胞(HPP-CFC)、紅系集落形成單位(CFU-E)及粒-巨噬系集落形成單位(CFU-GM)集落形成狀況，并進一步探討銀屑病患者外周血單一核細胞(PBMC)培養(yǎng)上清對骨髓造血細胞集落形成的影響，揭示銀屑病患者骨髓造血細胞活性及其與外周血免疫異常間的關(guān)系； 2.將銀屑病患者骨髓造血細胞體

4、外定向分化為成熟T細胞，通過檢測T細胞活性以反映骨髓造血細胞在T細胞異常免疫活性形成中的作用，以進一步揭示骨髓與銀屑病發(fā)病間的關(guān)系。 方法和結(jié)果：1.銀屑病患者骨髓造血細胞體外集落形成分析a.銀屑病患者骨髓造血細胞HPP-CFC、CFC-E及CFC-GM分析：密度梯度離心法分離骨髓單一核細胞(BMMNC)，采用甲基纖維素半固體集落培養(yǎng)法研究銀屑病患者及正常人骨髓HPP-CFC、CFU-E及CFU-GM集落形成。結(jié)果顯示銀屑病患者

5、的HPP-CFC及CFU-GM的集落形成數(shù)較正常對照顯著減少，而CFU-E集落數(shù)與正常對照比較無顯著差異。 b.銀屑病患者PBMC培養(yǎng)上清對骨髓HPP-CFC、CFC-E及CFC-GM的影響：將銀屑病患者及正常對照PBMC培養(yǎng)上清加入正常人骨髓HPP-CFC、CFU-E及CFU-GM培養(yǎng)體系，觀察銀屑病患者PBMC對骨髓造血活性的影響。結(jié)果顯示銀屑病患者PBMC培養(yǎng)上清作用后，HPP-CFC、CFU-E及CFU-GM集落形成數(shù)較

6、自然增殖組及正常人PBMC培養(yǎng)上清作用組顯著減少；而正常人PBMC培養(yǎng)上清作用組與自然增殖組無顯著差異。 2.銀屑病患者骨髓造血細胞體外定向分化的T細胞活性研究a胸腺基質(zhì)細胞支持下骨髓造血細胞向T細胞體外定向分化：免疫磁珠法分離骨髓CD34+細胞，在骨髓基質(zhì)細胞條件培養(yǎng)液構(gòu)建的微環(huán)境下，在胸腺基質(zhì)細胞的支持下，使其體外向T細胞定向分化，收集培養(yǎng)的非貼壁細胞，免疫熒光染色后經(jīng)流式細胞術(shù)檢測培養(yǎng)不同時間CD1-CD3+細胞、CD3+

7、CD4+CD8-細胞及CD3+CD4-CD8+細胞比例，建立穩(wěn)定的骨髓造血細胞向T細胞定向分化的方法。結(jié)果顯示，培養(yǎng)1周時，培養(yǎng)細胞中以不成熟的CD1+CD3-細胞、CD1+CD3+細胞為主，可檢測到少量CD1-CD3+細胞，隨培養(yǎng)時間延長，不成熟細胞比例逐漸減少，而成熟的CD1-CD3+細胞比例逐漸增加；在CD3+細胞中，培養(yǎng)初期以不成熟的雙陽性細胞CD4+CD8+為主，而成熟的單陽性CD4+CD8-細胞及CD4-CD8+細胞占極小比

8、例，隨培養(yǎng)時間延長，雙陽性細胞比例逐漸減少，而成熟的雙陽性細胞比例逐漸降低；而無胸腺基質(zhì)細胞支持的CD34+細胞僅在培養(yǎng)初期檢測到成熟細胞存在，而培養(yǎng)后4周基本檢測不到成熟T細胞的存在。 b銀屑病患者骨髓造血細胞體外定向分化的T細胞增殖活性及分泌細胞因子水平研究：免疫磁珠法分離家族史陽性銀屑病患者及正常對照骨髓CD34+細胞，在骨髓基質(zhì)細胞條件培養(yǎng)液構(gòu)建的微環(huán)境下，在胸腺基質(zhì)細胞的支持下，使其體外向T細胞定向分化，免疫磁珠法收集

9、CD3+T細胞，流式細胞術(shù)檢測CD4+CD8-細胞及CD4-CD8+細胞比例。分別采用MTT法及ELISA法檢測自然增殖組及鏈球菌超抗原(SAg)刺激后T細胞增殖活性及分泌細胞因子水平。結(jié)果顯示，經(jīng)骨髓CD34+細胞定向分化并擴增的CD3+T細胞中可檢測到CD4+CD8-、CD4-CD8+T細胞，且銀屑病患者組及正常對照組CD4+CD8-及CD4-CD8+T細胞比例無顯著差異；銀屑病患者骨髓CD34+細胞定向分化的T細胞自然增殖組及SA

10、g刺激組增殖活性均顯著高于正常人對照組；銀屑病患者T細胞自然增殖組培養(yǎng)上清IL-4、IL-8及IFN-γ與正常對照無顯著差異，SAg刺激后IL-4表達水平無顯著改變，而IL-8及IFN-γ水平卻顯著高于正常人。 c銀屑病患者骨髓造血細胞體外定向分化的T細胞對KCc-myc、bcl-xL、p53及ki67蛋白表達的影響：在胸腺基質(zhì)細胞的支持下，將銀屑病患者骨髓CD34+細胞體外定向分化為T細胞，收集T細胞并采用IL-2、PHA及S

11、Ag進一步擴增及活化T細胞，將T細胞與KC共培養(yǎng)，分別采用SP免疫組化法及ELISA法檢測KCc-myc、bcl-xL、p53及ki67蛋白表達及培養(yǎng)上清中IL-8、IFN-γ水平。結(jié)果顯示，受銀屑病患者造血細胞定向分化的T細胞作用的KCc-myc及Ki67蛋白表達與自然增殖組及正常人造血細胞定向分化的T細胞作用組相比顯著增強，而bcl-xL及p53蛋白表達三組間無顯著差異；受正常人T細胞作用的KCc-myc、bcl-xL、p53及Ki

12、67蛋白表達與自然增殖組比較差異無顯著性；銀屑病造血細胞定向分化的T細胞作用組培養(yǎng)上清IL-8及IFN-γ水平顯著高于正常對照。 結(jié)論：1.銀屑病患者骨髓造血細胞HPP-CFC及CFU-GM集落形成能力顯著低于正常對照，進一步研究表明銀屑病患者PBMC上清可顯著抑制骨髓HPP-CFC、CFU-E、CFU-GM集落形成，表明銀屑病患者骨髓造血細胞增殖活性顯著降低，可能在一定程度上和外周血免疫異常所致的骨髓造血微環(huán)境改變有關(guān)，提示骨