藥用植物肖菝葜的內生真菌生物多樣性研究.pdf

1、內生菌是其生活史中的某一段時期或全部時期無癥狀地生活在植物組織內的真菌或細菌。近二十年來，人們開始關注并進行內生真菌的研究。從目前已經研究過的植物來看，內生真菌在植物中普遍存在，二者在協(xié)調進化過程中形成了互惠共生關系。內生真菌一方面可以從宿主中吸收營養(yǎng)供自己生長需要，一方面在宿主的生長發(fā)育和系統(tǒng)演化過程中起重要作用如：增強宿主的生長、抗干旱能力、抗病蟲害能力、產生有生理活性的代謝物質等。內生真菌在生態(tài)環(huán)境中扮演的眾多角色，尚待發(fā)掘的豐富

2、資源和具有藥用價值生理活性代謝物，構成內生真菌研究的巨大動力。但相對于其他真菌類群的研究來說，我們對內生真菌的認識還很膚淺，絕大部分植物內生真菌群落仍然是未知的。 內生真菌能產生與宿主相同或相似的具有生理活性的代謝產物，利用能產生生理活性物質的內生真菌發(fā)酵生產治療疾病的藥物，可以節(jié)約天然植物資源和保護生態(tài)環(huán)境。藥用植物肖菝葜，為菝葜科肖菝葜屬常用中草藥，其干燥根莖或者整個植株被稱為“白土茯苓”入藥，具有利尿，除濕，解毒，通利關節(jié)

3、等功能。肖菝葜內生真菌是否可以產生有生理活性的次生代謝產物呢?關于肖菝葜內生真菌的研究尚未見報道。本文利用分子生物學技術研究藥用植物肖菝葜內生真菌生物多樣性，旨在為探索肖菝葜內生真菌的巨大潛在應用價值提供基礎研究。 本論文采用光鏡觀察和分子生物學技術，對肖菝葜春季和夏季莖組織內生真菌多樣性進行研究。作者用苯胺藍染色光鏡觀察法直接觀察在肖菝葜莖組織內部內生真菌的分布情況。肖菝葜莖組織是柱狀體，橫切面近似圓形，皮層細胞內散布著被苯胺

4、藍染色的真菌菌絲。夏季采集的樣品在皮層細胞的第2-3層散布，而春季采集的樣品在皮層細胞的第5-6層致密分布。通過直接觀察分析，春季肖菝葜莖組織內生真菌較夏季豐富。 為了考察內生真菌群落構成，分別提取春、夏兩季莖組織的總DNA，利用真核生物通用引物LH2/Sm73選擇性擴增核糖體轉錄間隔區(qū)(rDNAITS區(qū))片段，結果表明，LH2/Sm73成功地同時擴增出植物和真菌rDNAITS目的片斷。PCR產物經割膠純化，分別構建春、夏兩季莖

5、組織內生真菌以及植物ITS區(qū)序列的克隆文庫。真菌文庫分別隨機篩選150個克隆子，植物文庫篩選19個陽性克隆子。對陽性克隆子的插入片段進行限制性內切酶酶切片段長度多態(tài)性(RFLP)分析，對每一種RFLP型的克隆子進行序列測定和生物多樣性分析。結果表明：植物rDNAITS文庫的陽性克隆子RFLP型具有同質性，經測序分析為植物rDNAITS區(qū)序列。夏季肖菝葜文庫(XJB)篩選的14個RFLP型全部被春季肖菝葜文庫(YJ4)篩選出的44個RFL

6、P型覆蓋，表明春季肖菝葜莖組織內生真菌群落較夏季更為豐富。 從YJ4文庫的每種RFLP型中隨機挑選不少于兩個克隆子，其質粒DNA用載體通用引物P47或P48進行序列測定。使用Blastn程序，對測定的序列與國際基因數(shù)據(jù)庫GenBank和EMBL中的相關序列進行同源性分析，這49條序列可以歸入真菌域。在49個真菌rDNAITS區(qū)序列中只有YJ4-Ⅲ4，與擔子菌同源性較高，其余48條rDNAITS區(qū)序列，與子囊菌同源性高。49個真菌

7、序列中，有12個序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中最近源序列相似率在99％以上，其中YJ4-1，YJ4-26和YJ4-46與其最近源序列相似率為100％；有9個序列與近源序列相似率在90％到98％之間；有13個序列與近源序列相似率在75％到90％之間；有15個序列與已知的ITSrDNA序列相似率在75％以下，其中YJ4-93與近源序列相似率為47.0％。 生物多樣性分析表明內生真菌主要的群落構成為：球腔菌屬(Mycosphaerell

8、a)，擬莖點霉屬(Phomopsis)，小叢殼屬(Glomerella)，短梗霉屬(Aureobasidium)，枝孢屬(Cladosporium)，殼梭孢屬(Fusicoccum)，球座菌屬(Guignardia)，葡萄座腔菌科(Botryosphaeriaceae)和銹菌綱(Urediniomycetes)。其中球腔菌屬(Mycosphaerella)，擬莖點霉屬(Phomopsis)，小叢殼屬(Glomerella)和短梗霉屬(A

9、ureobasidium)為主要優(yōu)勢類群。還有幾個序列，如YJ4-61，與基因數(shù)據(jù)庫內的序列同源性非常低；有些序列，如YJ4-9和YJ4-70與環(huán)境樣本的序列相似率很高。 本研究首次通過肖菝葜莖組織rDNAITS文庫的構建和分析，綜合運用分子生物學、生物信息學和分子系統(tǒng)學的方法，探討肖菝葜莖組織內生真菌生物多樣性，并深入比較分析春、夏兩季肖菝葜內生真菌群落結構差異。揭示了肖菝葜內生真菌群落構成具有十分豐富的多樣性，且其構成與豐度