熱量限制預(yù)防及延緩動(dòng)脈硬化發(fā)生發(fā)展機(jī)制的研究.pdf

1、心腦血管疾病是發(fā)達(dá)國家人口死亡的主要原因，在我國的死亡率也呈逐年增高的傾向。而動(dòng)脈粥性硬化(atherosclerosis，AS)性心血管疾病則被稱為發(fā)達(dá)國家的“頭號(hào)殺手”，它在發(fā)展中國家發(fā)病率也越來越高(ShimizuT,2008)。其中冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病(coronaryatheroselerosisheartdisease)簡稱冠心病(coronaryheartdisease，CHD)是一種常見疾病，己成為歐美國家最多見的心

2、臟病種。1990年全球人口為53億，死亡5000萬，其中630萬死于冠心病，占12.4％。1991年美國心臟協(xié)會(huì)公布，1988年冠心病死亡人數(shù)占總死亡的45.3％，約1/5的美國人在65歲前死于心血管病。作為亞洲國家，我國目前冠心病發(fā)病率和死亡率仍處于較低發(fā)國家的行列，但隨著人們生活方式的改變，近年來有增高的趨勢。在住院心臟病患者中，本病所占的比例也不斷增加。而冠心病的基本病因?yàn)閯?dòng)脈粥樣硬化(atherosderesis，As)，而AS

3、斑塊的不穩(wěn)定，引起局部血小板聚集，急性血栓形成，管腔急性閉塞是急性冠脈綜合征(acutecoronarysyndrome，ACS)發(fā)生的共同機(jī)制。隨著我國經(jīng)濟(jì)社會(huì)的發(fā)展，人民生活水平提高和飲食水平習(xí)慣改變，以及隨之而來的人口的老齡化，動(dòng)脈粥性硬化引發(fā)的疾病也逐漸成為我國主要死因(牟一鳴等，2001)。世界衛(wèi)生組織預(yù)測，在世界范圍內(nèi)的傳染性疾病病死率得到有效控制之后，到2020年心管管疾病將成為全世界第一死因。
　　 動(dòng)脈粥樣硬化

4、(atherosclerosis，AS)是心腦血管疾病的重要病理基礎(chǔ)，防治AS是防治心腦血管病的根本措施。動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是以富含脂質(zhì)的斑塊在大動(dòng)脈壁聚集為特征的系統(tǒng)疾病，是心腦血管病的主要病理基礎(chǔ)，它是一種多因素所致的動(dòng)脈血管慢性疾病，集中表現(xiàn)為全身性血管內(nèi)皮功能障礙(endothelialdysfunction)、血管內(nèi)膜慢性炎癥、纖維增生、管腔狹窄及血栓形成等。其主要臨床表現(xiàn)是心肌梗塞、中風(fēng)和外

5、周血管疾病，常伴有高血壓、高膽固醇血癥或糖尿病等。AS病因病理復(fù)雜，目前尚未完全闡明，但可以確定的是AS是一類涉及到多種遺傳因素和環(huán)境因素的復(fù)雜疾病，這些遺傳因素和環(huán)境因素之間的相互作用最終導(dǎo)致斑塊形成和出現(xiàn)隨后的一系列臨床事件。AS性血管疾病病因眾多，其中不少與生活方式密切相關(guān)，包括吸煙、高糖高脂飲食、缺乏體力活動(dòng)等習(xí)慣。從生物學(xué)角度來看，AS是一種長期慢性炎癥疾病，與血脂紊亂密切相關(guān)，其發(fā)生發(fā)展是一個(gè)十分復(fù)雜的過程。AS性疾病臨床事

6、件主要為冠心病和中風(fēng)。
　　 因此，對AS發(fā)生機(jī)制的研究日益受到關(guān)注，血脂增高和紊亂是大多數(shù)AS發(fā)生的前提和基礎(chǔ)，血管內(nèi)皮功能障礙是AS發(fā)生的始發(fā)事件，多種因素相互作用，導(dǎo)致了AS的發(fā)生、發(fā)展。其中主要因素包括:血管內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙，血管平滑肌細(xì)胞增生，血小板和血液凝固狀態(tài)異常，單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞浸潤，自由基損傷，病毒及細(xì)菌感染，細(xì)胞凋亡，炎癥和免疫反應(yīng)，鈣離子沉積，基因異常等。目前普遍認(rèn)認(rèn)同的發(fā)病機(jī)制是“損傷應(yīng)激學(xué)說”(Ros

7、sR,1999)。該學(xué)說認(rèn)為AS的過程包括以下幾個(gè)步驟:內(nèi)皮細(xì)胞（vascularendothelialcell，VEC）受各種刺激而損傷;單核細(xì)胞通過損傷處進(jìn)入內(nèi)膜，轉(zhuǎn)變?yōu)榫奘杉?xì)胞;巨噬細(xì)胞在與協(xié)同的T淋巴細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子的作用下轉(zhuǎn)變?yōu)榫奘杉?xì)胞源性泡沫細(xì)胞;動(dòng)脈中膜的血管平滑肌細(xì)胞遷入內(nèi)膜，吞噬脂質(zhì)形成平滑肌源性泡沫細(xì)胞，并增生遷移形成纖維帽;纖維帽被巨噬細(xì)胞分泌的基質(zhì)金屬蛋白酶和T淋巴細(xì)胞分泌的γ-干擾素削弱，使斑塊破裂而移動(dòng)，形

8、成動(dòng)脈粥樣理化的栓子。
　　 關(guān)于AS的形成，近年來免疫炎癥學(xué)說越來越受到重視。研究認(rèn)為AS是對血管內(nèi)皮局部損傷的一種保護(hù)性炎癥—纖維增殖性回應(yīng)。如果損傷持續(xù)一段時(shí)間，這種回應(yīng)則變得過度，最終成為疾病即斑塊形成。在斑塊的形成過程中脂質(zhì)沉積是最重要的因素，也是損傷反應(yīng)最早期的表現(xiàn)之一。伴隨著脂質(zhì)的沉積，氧化低密度脂蛋白膽固醇(oxLDL—C)的形成，循環(huán)中的白細(xì)胞和單核細(xì)胞被激活，并遷移到病變處，后者在oxLDL—C作用下變成活化

9、的巨噬細(xì)胞，通過他們的清道夫受體，攝取oxLDL-C變成泡沫細(xì)胞，泡沫細(xì)胞的不斷產(chǎn)生和堆積導(dǎo)致脂質(zhì)條紋的形成。泡沫細(xì)胞死亡時(shí)則釋放大量的膽固醇酷與血漿脂蛋白的沉積構(gòu)成斑塊下的脂質(zhì)核心。炎癥應(yīng)答繼續(xù)發(fā)展，T細(xì)胞活化，則引發(fā)纖維增殖反應(yīng)最終形成纖維帽。在斑塊形成的早期脂質(zhì)核心小，纖維帽厚，斑塊呈穩(wěn)定狀態(tài)，伴隨著泡沫細(xì)胞的不斷死亡和血漿脂類的沉積，斑塊下的脂質(zhì)核心不斷增大，另一方面大量巨噬細(xì)胞浸潤釋放大量水解酶，尤其是金屬蛋白酶系列，通過降解

10、纖維帽以及抑制膠原纖維的生成使纖維帽逐漸變薄，從而使穩(wěn)定斑塊轉(zhuǎn)為不穩(wěn)定斑塊，后者在內(nèi)、外因素作用下，最終發(fā)生破裂導(dǎo)致急性冠脈事件發(fā)生。病理學(xué)家亦發(fā)現(xiàn)在斑塊的破裂部位可見大量巨噬細(xì)胞浸潤，炎性標(biāo)記物表達(dá)增加。由此可見，斑塊的不斷進(jìn)展與炎癥反應(yīng)的程度密切相關(guān)。斑塊是否發(fā)生破裂與斑塊內(nèi)的炎癥反應(yīng)強(qiáng)度及巨噬細(xì)胞的浸潤程度有密切的關(guān)系。動(dòng)脈壁內(nèi)脂紋或斑塊形成是AS的特征性病變，而動(dòng)脈內(nèi)膜的巨噬細(xì)胞以及由中膜向內(nèi)膜遷移的平滑肌細(xì)胞經(jīng)由清道夫受體(s

11、cavengerreceptor，SR)攝取氧化低密度脂蛋白(oxidizedLDL，oxLDL)，從而形成巨噬/平滑肌細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞，是AS特征性病變發(fā)生發(fā)展過程中的一個(gè)核心事件。
　　 人們對衰老與長壽的研究逾近百年，但至今為止，控制人類壽命之迷仍未被揭開。盡管衰老本身不是一種疾病，但很多疾病與衰老相關(guān)，如腫瘤，老年癡呆(Alzheimer'sdisease)，動(dòng)脈硬化，代謝紊亂(metabolicdisorders)等。

12、心臟病和中風(fēng)引起的死亡率隨年齡呈指數(shù)增加，65-74歲死亡率超過40％，85歲及以上的死亡率將近60％。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，即使沒有高血壓，糖尿病及吸煙等各種危險(xiǎn)因子存在，心血管系統(tǒng)隨年齡增加亦趨于易發(fā)疾病和受損，這可能和衰老血管的細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)相關(guān)（Ungvarietal.，2010）。在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和人的身上都已證實(shí)，氧化損傷產(chǎn)生的活性氧(reactiveoxygenspecies，ROS)激活NAD(P)H氧化酶及下調(diào)NO的活性，導(dǎo)致衰老

13、進(jìn)程的內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙，從而引發(fā)老年人冠狀動(dòng)脈疾病和中風(fēng)。
　　 熱量限制(calorierestiction，CR)是指在提供生物體充分的營養(yǎng)成分如必需氨基酸、維生素等，保證生物體不發(fā)生營養(yǎng)不良的情況下，限制每日攝取的總熱量。一般CR飲食是指減少動(dòng)物隨意進(jìn)食量的30％-40％。熱量限制功能以一種被動(dòng)的方式降低氧化和其他損傷，從而導(dǎo)致生命周期延長，可以調(diào)控從酵母到哺乳動(dòng)物等生物體的生命周期。自1935年McCay等首次報(bào)道CR延

14、長大鼠壽命以來，大量研究已表明CR是除遺傳操作以外最強(qiáng)有力的延緩衰老的方法。熱量限制不僅能維持許多年輕時(shí)的生理狀態(tài)，還能延緩和預(yù)防一些與年齡相關(guān)疾病如心血管疾病、糖尿病、腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。熱量限制(caloricrestriction，CR)是已經(jīng)被證明具有抗衰老及延長壽限的作用(RussellJC2008;FontanaL，2009;)，包括熱量攝入限制和減少進(jìn)食次數(shù)兩種方式。CR對心血管系統(tǒng)具有多效保護(hù)作用，如保護(hù)血管（阻止動(dòng)脈硬化

15、進(jìn)程），提高心肌耐受性及延緩心臟衰老(ShinmuraK，2011)。衰老進(jìn)程中，轉(zhuǎn)錄因子NF-kB通過激活I(lǐng)L-1，IL-6，TNF-a等細(xì)胞因子介導(dǎo)機(jī)體長期慢性炎癥反應(yīng)，這種長期慢性炎癥反應(yīng)引發(fā)一系列老年相關(guān)疾病的關(guān)鍵。因此，有人提出可以通過抗氧化藥物(如姜黃素(curcumin))來抑制依賴NF-kB信號(hào)的炎癥反應(yīng)，而延緩衰老(SikoraEabetal.，2010)。研究表明，CR可以降低炎癥因子IL-6和leptin的表達(dá)(R

16、eedJL，2010)。
　　 本課題分為四個(gè)部分，首先依據(jù)已經(jīng)發(fā)表的芯片數(shù)據(jù)結(jié)果進(jìn)行生物信息學(xué)的分析和挖掘，具體為:來源于美國MillerSJ提交的GSE7281芯片數(shù)據(jù)集，F(xiàn)ischer344大鼠自然衰老，年齡分別為3，6，15，28個(gè)月，取大鼠動(dòng)脈提取mRNA進(jìn)行全基因組芯片分析。http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE7281;和來源于美國BeckerKG

17、提交的GSE11845芯片數(shù)據(jù)集，選取數(shù)據(jù)集中正常對照（自由飲食），熱量限制（間斷飲食）及高脂（氫化椰子油，熱量高于正常對照組的60％）三組樣本數(shù)據(jù)，進(jìn)行心臟，肝臟及肌肉相關(guān)基因分析。http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE11845。挖掘動(dòng)脈硬化與衰老相關(guān)基因。接下來建立Wistar大鼠模型，利用RT-PCR，ELISA等方法進(jìn)行血清氧化低密度脂蛋白(OXLDL)，C反

18、應(yīng)蛋白（C-reactiveprotein，CRP），血栓前體蛋白(TpP)等靶標(biāo)的檢測以及進(jìn)行病理分析觀察血管形態(tài)，對芯片數(shù)據(jù)挖掘的結(jié)果進(jìn)行進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。在建立高糖飲食與熱量限制的大鼠模型的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)(Real-timequantitativePolymeraseChainReaction，RealTimePCR)驗(yàn)證生物信息學(xué)結(jié)果并篩選得到31個(gè)同時(shí)響應(yīng)熱量限制與高脂高糖飲食的基因表達(dá)。通過建立HC

19、誘導(dǎo)動(dòng)脈硬化的細(xì)胞模型（細(xì)胞株EA.hy926），對高糖高膽固醇誘導(dǎo)EA.hy926細(xì)胞凋亡中對分子伴侶家族一員，HSP60蛋白的表達(dá)進(jìn)行了初步的研究。
　　 結(jié)果分述如下:
　　 1.生物信息學(xué)挖掘動(dòng)脈硬化與衰老相關(guān)基因。
　　 通過年齡相關(guān)大鼠動(dòng)脈芯片表達(dá)譜比較共獲得166條探針（155個(gè)基因），其中有36個(gè)基因響應(yīng)熱量限制與高脂高糖飲食。其中Aldh5a1，Ldha,Hk2,Pfkp,Slc2a4,Dlat

20、,Tkt等參與糖代謝，在大鼠衰老的進(jìn)程中呈下降趨勢;而Gyg1參與肝糖原合成，隨年齡增加而持續(xù)上調(diào)。HK2,PFKP,Dlat,Pdp2,Acyl等是糖酵解與三羧酸循環(huán)的關(guān)鍵調(diào)控酶，Tkt,TECR與ACS15則是NADPH提供途徑的關(guān)鍵酶。在大鼠衰老的進(jìn)程中，糖代謝相關(guān)的酶表達(dá)下調(diào)，NADPH生成途徑受阻，表明在個(gè)體發(fā)育成熟后，機(jī)體對能量的需求可能減少，NADPH下降可能將導(dǎo)致SIRT1的活性下降。有報(bào)道SIRT1對血管及在動(dòng)脈硬化中

21、具有保護(hù)作用，它在熱量限制介導(dǎo)機(jī)體壽限的延長中起到非常重要調(diào)作用。因此，通過熱量限制可能上調(diào)這些基因的表達(dá)，對機(jī)體的“燃料”進(jìn)行充分燃燒，減少脂肪堆積，延長壽限。
　　 生物信息學(xué)的分析表明，隨著年齡的增長，大鼠動(dòng)脈血管的細(xì)胞粘附因子Vcam1，Icam1，Postn,Fn1，Sdc1，Mfge8，Spp1，Jup，Tln1上調(diào)表達(dá)，表明內(nèi)皮細(xì)胞隨年齡增長功能下降，容易誘發(fā)動(dòng)脈硬化。與血管發(fā)育相關(guān)的Agt,Colla1，Gja5

22、隨年齡增長而下調(diào)，而參于血管調(diào)節(jié)與重塑Bgn,Acvrl1，F(xiàn)gfr1，Bax等則上升。這些基因可能參與高血壓的發(fā)生，推測熱量限制可能抑制Bgn,Acvrl1的表達(dá)。此外，參與免疫的HSPD1與抗氧化的Pex19,Cyld等基因隨年齡呈下降趨勢，熱量限制顯著提高他們的表達(dá)。隨著年齡的增長，動(dòng)脈硬化的易感基因表達(dá)上調(diào)，表明患動(dòng)脈硬化的風(fēng)險(xiǎn)增加;而熱量限制可以下調(diào)這些基因的表達(dá)，推測其可能預(yù)防或延緩動(dòng)脈硬化的發(fā)生。
　　 2.高糖高

23、脂誘導(dǎo)大鼠動(dòng)脈硬化模型建立以及生物信息學(xué)結(jié)果的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。
　　 將44只6月和40只11月大的SPF級(jí)的Wistar雄性大鼠進(jìn)行隨機(jī)分組，F(xiàn)C（自由飲食組）給予基本飼料和普通算來水喂養(yǎng);CR（熱量限制組）每天定時(shí)給予基本飼料100～150g/3只老鼠，此根據(jù)老鼠一天能剛吃完飼料重量而定;HC（高糖高脂組），飼料組成為:基本飼料+15％豬油+3％膽固醇+5％精制糖。各組大鼠進(jìn)行2個(gè)月和4個(gè)月喂食后，心臟取血后，通過血清OXLDL和

24、血漿TpP含量檢測，以及血液中CRP的mRNA檢測表明，本實(shí)驗(yàn)通過高糖高脂喂養(yǎng)的大鼠更有誘發(fā)動(dòng)脈硬化的可能性。并且隨年齡增長，長期高糖高脂飲食罹患動(dòng)脈硬化的可能性更大，而熱量限制飲食即可減低此風(fēng)險(xiǎn)。
　　 在建立高糖飲食與熱量限制的大鼠模型的基礎(chǔ)上，通過Q-PCR檢測生物信息學(xué)篩選得到31個(gè)同時(shí)響應(yīng)熱量限制與高脂高糖飲食的基因表達(dá)。結(jié)果表明，熱量限制可以上調(diào)成年大鼠動(dòng)脈中Aldh5a1(F=5.301，P=0022)，Ldha(

25、F=2.215,P=0.016),Hk2(F=3.556,P=0.061),Pfkp(F=3.045,P=0.085),Slc2a4(F=4.006,P=0.046),Dlat(F=3.389,P=0.068),Tkt(F=0.177,P=0.008),Gyg1(F=5.831,p=0.017)等參與糖代謝相關(guān)的基因，而高糖高脂的飲食則起到相反的作用。同時(shí)，熱量限制還可以有效抑制Icam1(F=3.739,P=0.045)和Tln1(1

26、.546,P=0.050)的表達(dá)，但對Vcam1(F=0.177，P=0.267)和Fn1(F=1.495，P=0.102)作用不明顯。ZouY等報(bào)道熱量限制可以有效抑制不同年齡大鼠Icam1和Vcam1的表達(dá)，但熱量限制的時(shí)間持續(xù)13和31個(gè)月。本研究是在成年鼠后進(jìn)行熱量限制4個(gè)月進(jìn)行檢測，可能由于處理時(shí)間偏短，從而影響了結(jié)果。此外，熱量限制還可以有效抑制Bgn(F=13.189,P=0.001)，Acvrl1(F=2.306,P=0

27、.142)的表達(dá)，而上調(diào)HSPD1(F=3.191,P=0.075),Pex19(2.474,P=0.126),Cyld(F=1.888,P=0.194)等基因的表達(dá)。高糖飲食則相反。
　　 3.高糖高膽固醇誘導(dǎo)EA.hy926細(xì)胞凋亡中對HSPD1基因表達(dá)的影響
　　 隨膽固醇濃度的增加，EA.hy926細(xì)胞活性下降，呈濃度依賴性。0.8mM膽固醇+5mM葡萄糖共培養(yǎng)12h的細(xì)胞活性與正常對照組(5mM葡萄糖+0mM膽

28、固醇)無顯著差異(P＞0.056)，而0.8mM膽固醇+25mM葡萄糖共培養(yǎng)12h的細(xì)胞活性與正常對照組（25mM葡萄糖+0mM膽固醇）具顯著性差異(F=579.023，P=0.001)。5mM或25mM葡萄糖+0.8mM膽固醇處理EA.hy926細(xì)胞不同時(shí)間后，細(xì)胞活性呈時(shí)間依賴性下調(diào)，48h后細(xì)胞大部分變圓，脫落(F=79.758,P＜0.001)。流式檢測表明此時(shí)，與低糖低脂處理的細(xì)胞比較，高糖高膽固醇處理的細(xì)胞大部分發(fā)生凋亡（F

29、=127.068,P＜0.001），HSPD1基因表達(dá)顯著上調(diào)(F=6.959,P=0.006)。
　　 通過上述三個(gè)部分的實(shí)驗(yàn)，我們得出以下結(jié)論:
　　 1.隨著年齡的增長，動(dòng)脈硬化的易感基因表達(dá)上調(diào)，表明患動(dòng)脈硬化的風(fēng)險(xiǎn)增加。
　　 2.熱量限制可以下調(diào)這些基因的表達(dá)，推測其可能預(yù)防或延緩動(dòng)脈硬化的發(fā)生。
　　 3.高糖高脂喂養(yǎng)的大鼠，長期的HC飲食可使血液中的OXLDL升高;血漿中TpP水平顯著高于

30、FC組;而CR組顯著低于FC組;從動(dòng)脈血管橫切圖看，HC組的血管內(nèi)皮顯著增厚，并不同程度的形成泡沫細(xì)胞。表明HC組大鼠動(dòng)脈已有不同程度動(dòng)脈硬化的病變，更有誘發(fā)動(dòng)脈硬化的可能性。并且隨年齡增長，長期高糖高脂飲食罹患動(dòng)脈硬化的可能性更大，而熱量限制飲食即可減低此風(fēng)險(xiǎn)。
　　 4.熱量限制可以上調(diào)成年大鼠動(dòng)脈中Aldh5a1，Ldha,Hk2，Pfkp,Slc2a4,Dlat，Tkt，Gyg1等參與糖代謝相關(guān)的基因，而高糖高脂的飲食則

31、起到相反的作用。同時(shí)，熱量限制還可以有效抑制Icam1，Tln1，Bgn，Acvrl1，F(xiàn)gfr1，Bax的表達(dá)，而上調(diào)HSPD1，Pex19，Cyld等基因的表達(dá)。高糖飲食則相反。即并且隨著年齡的增長，動(dòng)脈硬化的易感基因表達(dá)上調(diào)，患動(dòng)脈硬化的風(fēng)險(xiǎn)增加;而熱量限制可以下調(diào)這些基因的表達(dá)，從而預(yù)防或延緩動(dòng)脈硬化的發(fā)生。相反，高糖高脂飲食則起相反的作用，加快發(fā)病及病變的進(jìn)程。
　　 5.持續(xù)激活的HSP60通過激活人血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)