Wnt信號(hào)通路中ARMC6的功能研究.pdf

1、前言：
　　 Wnt信號(hào)傳導(dǎo)通路(Wntsignalingpathway)在進(jìn)化過(guò)程中保持穩(wěn)定,廣泛存在于生物的信號(hào)傳遞系統(tǒng)中,已經(jīng)證實(shí)的生物有線蟲,斑馬魚,果蠅,非洲爪蟾,老鼠等等,在人類的信息傳遞系統(tǒng)中更是發(fā)揮著重要作用,已證實(shí)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中廣泛分布。Wnt信號(hào)通路的假說(shuō)根據(jù)其受體及產(chǎn)生效應(yīng)的不同主要分為三種,其中研究比較深入的是經(jīng)典Wnt通路,又稱Wnt/β-連環(huán)蛋白(β-catenin,β-cat)通路。研究表明,經(jīng)典

2、Wnt/β-cat通路激活后通過(guò)破壞β-cat降解復(fù)合物的形成使β-cat的保持穩(wěn)定并積累于細(xì)胞質(zhì)內(nèi),繼而進(jìn)入細(xì)胞核激活靶基因表達(dá)。經(jīng)典Wnt/β-cat通路在生物早期發(fā)育和器官演化過(guò)程中有著舉足輕重的調(diào)節(jié)作用,主要作用有調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖,生長(zhǎng)和遷移。通常情況下,隨著生物體的發(fā)育成熟,大部分器官內(nèi)的Wnt信號(hào)通路功能逐漸減退,β-cat的濃度維持在較低水平。但是有研究表明,β-cat和Wnt信號(hào)傳導(dǎo)通路的重要因子在腦組織中仍然大量存在。研

3、究發(fā)現(xiàn),在成熟的機(jī)體中,Wnt信號(hào)通路的作用則是維持細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)的穩(wěn)定。過(guò)度的刺激或者抑制該通路的正常生理功能均能產(chǎn)生相應(yīng)的疾病,如腫瘤發(fā)生和發(fā)展,阿爾茲海默疾病。近年的研究發(fā)現(xiàn),它還與化學(xué)物質(zhì)中毒也有一定的相關(guān)性,如重金屬中毒等等。
　　 糖原合成激酶3β(glycogensynthasekinase3p,GSK3β)最初發(fā)現(xiàn)于能量代謝過(guò)程中,主要的生化作用是對(duì)相應(yīng)蛋白質(zhì)的磷酸化作用。研究發(fā)現(xiàn)在Wnt信號(hào)傳導(dǎo)通路中,GSK3β

4、也發(fā)揮著舉足輕重的作用。經(jīng)典Wnt信號(hào)傳導(dǎo)通路中,GSK3β在Wnt蛋白的調(diào)控下與細(xì)胞內(nèi)膜的低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白5/6(low-densitylipoproteinreceptor-relatedprotein5/6,LRP5/6)-軸蛋白(Axin)相結(jié)合,從而使β-cat逃離被磷酸化繼而降解的命運(yùn)。細(xì)胞質(zhì)內(nèi)穩(wěn)定的β-cat通過(guò)細(xì)胞核孔進(jìn)入細(xì)胞核,與T細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子/淋巴細(xì)胞增強(qiáng)因子(T-celltranscriptionfacto

5、r/lymphoidenhancerfactor,TCF/LCF)相結(jié)合,啟動(dòng)下游基因的表達(dá),產(chǎn)生相應(yīng)生物學(xué)效應(yīng)。因此,在經(jīng)典Wnt信號(hào)傳導(dǎo)通路中是一個(gè)重要的切入點(diǎn)。
　　 總的來(lái)說(shuō),在Wnt細(xì)胞傳導(dǎo)通路中β-cat是連接細(xì)胞外刺激和細(xì)胞內(nèi)變化的重要信號(hào)因子,而β-cat發(fā)揮其信號(hào)傳導(dǎo)功能主要取決于它在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的量和存在的位置。分子生物對(duì)β-cat的結(jié)構(gòu)及功能域研究表明,其核心功能區(qū)域的蛋白三維結(jié)構(gòu)有12個(gè)β-折疊,其中的絲氨酸

6、/蘇氨酸位點(diǎn)為GSK3β的磷酸化位點(diǎn)。
　　 ARMC6(Armadillorepeatcontaining6)是細(xì)胞中能與GSK3p結(jié)合的蛋白之一,由轉(zhuǎn)染Flag-GSK3β載體的HEK293細(xì)胞勻漿液經(jīng)過(guò)α-Flag抗體免疫共沉淀,并使用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀(liquidchromatography-tandemmassspectrometry,LC-MS/MS)對(duì)免疫共沉淀所獲得的蛋白樣品進(jìn)行檢測(cè)而被發(fā)現(xiàn),已證實(shí)在人類基因組

7、中存在?？茖W(xué)家測(cè)定ARMC6純化蛋白的晶體結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)它具有6個(gè)β-折疊,與β-cat的12個(gè)β-折疊相似,因而推測(cè)ARMC6可能在Writ信號(hào)通路中也有發(fā)揮一定的功能,但是目前還沒(méi)有相關(guān)的研究報(bào)道。因此對(duì)于ARMC6的基本功能亟待研究。
　　 對(duì)象和方法：
　　 由于本實(shí)驗(yàn)主要是針對(duì)ARMC6基本功能的研究,本實(shí)驗(yàn)擬采用體外實(shí)驗(yàn)的方式,在細(xì)胞水平上研究ARMC6在Wnt信號(hào)通路中的作用基礎(chǔ)。采用的細(xì)胞主要是既能貼壁也能懸浮

8、生長(zhǎng)的HEK293T細(xì)胞系。
　　 首先,從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)獲得不同種屬的ARMC6的基因和氨基酸序列,比較不同種屬間ARMC6氨基酸序列的同源性。另外,以相應(yīng)的基因序列為模板,設(shè)計(jì)相應(yīng)的PCR擴(kuò)增引物序列,以人類cDNA文庫(kù),果蠅全基因DNA等為模板,使用PCR技術(shù)獲得目標(biāo)序列,并插入適合的載體中擴(kuò)增和保存。成功合成的載體經(jīng)基因測(cè)序證明準(zhǔn)確后,將載體濃度調(diào)整至1μg/μl,4℃保存,用于對(duì)目的基因的表達(dá)和功能研究。
　　

9、 其次,利用構(gòu)建成功的hARMC6和hGSK3β載體,在HEK293T細(xì)胞內(nèi)表達(dá),利用免疫共沉淀和Westernblotting技術(shù)研究hARMC6和hGSK3β以及Wnt信號(hào)傳導(dǎo)通路中的相關(guān)作用。并且利用純化的hARMC6和hGSK3B蛋白,根據(jù)體外激酶試驗(yàn)后放射性標(biāo)記的ATP的存在與否,來(lái)判斷對(duì)hARMC6的磷酸化能力。進(jìn)一步驗(yàn)證hARMC6和hGSK3β之間的相互關(guān)系。
　　 再次,構(gòu)建一系列不同種類的hARMC6變異型研

10、究hARMC6蛋白核心區(qū)域6個(gè)Arm重復(fù)序列的具體功能,研究在HEK293T細(xì)胞中異位表達(dá)的變異型的hARMC6與hGSK3β的相互關(guān)系,進(jìn)一步研究hARMC6與hGSK3β相互作用的具體部位。
　　 最后,按照與hGSK3β相同的實(shí)驗(yàn)條件研究hARMC6和Wnt信號(hào)通路其他因子之間的相關(guān)關(guān)系,進(jìn)一步確認(rèn)hARMC6在Wnt信號(hào)通路中的作用。根據(jù)體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中hARMC6與Wnt信號(hào)傳導(dǎo)通路中重要因子之間的關(guān)系,初步判斷ARMC

11、6在Wnt信號(hào)傳導(dǎo)通路中的作用,并為以后的整體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)提供理論依據(jù)。
　　 結(jié)果：
　　 首先,不同種屬間ARMC6氨基酸序列的同源性比較發(fā)現(xiàn),其蛋白核心區(qū)域(即6個(gè)Arm重復(fù)序列)的同源性水平較高。與人類ARMC6氨基酸序列核心區(qū)域相比,老鼠,非洲爪蟾和果蠅的同源性分別為95.7%,87.1%和66.0%。
　　 其次,在HEK293T細(xì)胞中異位表達(dá)的hARMC6和hGSK3β表現(xiàn)出一定程度的相關(guān)性。在體外激酶

12、試驗(yàn)中,純化蛋白hGSK3β可以磷酸化hARMC6。
　　 再次,所構(gòu)建的變異型hARMC6與hGSK3β的關(guān)系研究發(fā)現(xiàn),hAR_D_1A,hAR_D_1B和bAR_D_2A與hGSK3p不相連,而hAR_D_2B和bAR_D_3與hGSK3β有相關(guān)性。
　　 最后,在同樣的實(shí)驗(yàn)條件下,ARMC6與Wnt信號(hào)傳導(dǎo)通路的其他因子表現(xiàn)出程度不同的相關(guān)性(與APC相關(guān),但不能與Axin和β-cat免疫共沉淀),與β-cat的反

13、應(yīng)關(guān)系略有不同。
　　 結(jié)論：
　　 首先,同源性檢測(cè)說(shuō)明ARMC6的核心區(qū)域在進(jìn)化過(guò)程中保持穩(wěn)定,推測(cè)在細(xì)胞生理功能中有重要的作用。其次,異位表達(dá)的hARMC6和hGSK3β有相關(guān)性,體外激酶試驗(yàn)hGSK3β可以磷酸化hARMC6則進(jìn)一步說(shuō)明hARMC6和hGSK3β存在相互作用,ARMC6可能通過(guò)這個(gè)途徑參與Wnt信號(hào)傳導(dǎo)通路。再次,變異型hARMC6與hGSK3β的反應(yīng)關(guān)系說(shuō)明,hARMC6的6個(gè)Arm重復(fù)序列參與