e-Jun氨基末端激酶通路與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路在大鼠缺血再灌注腦損傷中的作用.pdf

1、第一部分 c-Jun氨基末端激酶通路在大鼠缺血再灌注腦損傷中作用的研究
　　 目的：
　　 觀察磷酸化的c-Jun氨基末端激酶(p-JNK)在大鼠缺血再灌注損傷腦組織中的變化規(guī)律，探討其抑制劑SP600125對(duì)大鼠缺血再灌注腦損傷的保護(hù)作用。
　　 方法：
　　 1.采用改良Longa線栓法制備大鼠大腦中動(dòng)脈缺血再灌注模型。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為對(duì)照組、缺血再灌注(IR)組、缺血再灌注+二甲亞砜(IR+DMSO

2、)組、缺血再灌注+DMSO+SP600125干預(yù)(IR+SP)組。IR+DMSO組及IR+SP組隨機(jī)分為缺血2 h再灌注6、12、24、72 h組。
　　 2.采用TTC染色觀察腦梗死體積，HE染色觀察缺血壞死神經(jīng)元改變。
　　 3.采用免疫組化和蛋白免疫印跡法(western blot)檢測(cè)各組活化的c-Jun氨基末端激酶p-JNK，觀察p-JNK在缺血再灌注腦組織不同時(shí)程的變化規(guī)律。
　　 4.觀察p-JNK

3、抑制劑SP600125對(duì)p-JNK表達(dá)的影響。
　　 結(jié)果：
　　 1.線栓法制備缺血再灌注模型成功率為75.6％；TTC染色可見大腦中動(dòng)脈供血區(qū)梗死灶；HE染色可見梗死區(qū)神經(jīng)元缺血壞死改變。
　　 2.p-JNK免疫組化研究顯示：對(duì)照組大鼠神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞棕褐色染色陰性。IR+DMSO組再灌注6h神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞胞核呈棕褐色染色；再灌注12h，胞核濃染，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)增多：再灌注24h陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)減少；至72

4、h陽(yáng)性表達(dá)仍持續(xù)較高水平。SP600125干預(yù)組大鼠神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞核為淺或中等程度棕黃色顆粒沉積，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)較IR+DMSO組減少(P<0.05)。
　　 3.Western blot研究發(fā)現(xiàn)，再灌注6h腦組織p-JNK表達(dá)升高，在12 h達(dá)高峰，24h表達(dá)略下降，72 h仍有較高表達(dá)。SP600125干預(yù)組較IR組及IR+DMSO組大鼠腦組織p-JNK表達(dá)顯著降低(P<0.01)，高峰不明顯(P>0.05)。
　　

5、 結(jié)論
　　 1.線栓法致大鼠腦組織缺血再灌注損傷后神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞表現(xiàn)為壞死樣形態(tài)改變。
　　 2.p-JNK的活性在腦損傷時(shí)表現(xiàn)出時(shí)間依賴性增高，該變化可被SP600125抑制。
　　 3.SP600125可減輕缺血再灌注造成的神經(jīng)元損傷。
　　 第二部分內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路在大鼠缺血再灌注腦損傷中的作用及p-JNK抑制劑的影響
　　 目的：
　　 觀察內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路中的凋亡相關(guān)蛋白GADD1

6、53、caspase-12在大鼠缺血再灌注腦損傷不同時(shí)程的變化規(guī)律，并探討p-JNK抑制劑SP600125對(duì)二者表達(dá)的影響。
　　 方法：
　　 1.建立大鼠大腦中動(dòng)脈閉塞再灌注模型，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為對(duì)照組、缺血再灌注(IR)組、缺血再灌注十二甲亞砜(IR+DMSO)組、缺血再灌注+DMSO+SP600125干預(yù)(IR+SP)組。IR+DMSO組及IR+SP組隨機(jī)分為缺血2 h再灌注6、12、24、72 h組。
　

7、　 2.采用免疫組化、Western blot及免疫熒光雙標(biāo)法檢測(cè)缺血再灌注不同時(shí)間點(diǎn)GADD153、caspase-12的變化。
　　 結(jié)果：
　　 1.免疫組化和免疫熒光雙標(biāo)檢測(cè)顯示腦缺血再灌注后皮層和紋狀體區(qū)GADD153表達(dá)均增高，神經(jīng)元及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞胞核、胞漿呈棕褐色染色，陽(yáng)性細(xì)胞主要位于紋狀體區(qū)，皮層表達(dá)較少，P<0.05；Western blot結(jié)果顯示再灌注6hGADD153表達(dá)增加，持續(xù)至72h仍明顯

8、增高，P<0.05。
　　 2.應(yīng)用SP600125干預(yù)后，與DMSO組比較，再灌注6、12h GADD153的表達(dá)變化不明顯(P>0.05)，24、72h GADD153的表達(dá)明顯下降(P<0.05)。
　　 3.免疫組化和免疫熒光雙標(biāo)檢測(cè)顯示腦缺血再灌注后皮層和紋狀體區(qū)caspase-12表達(dá)均增高，神經(jīng)元及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞胞漿呈棕褐色染色，而紋狀體caspase-12表達(dá)明顯高于皮層(P<0.05)；Western b

9、lot結(jié)果顯示再灌注6hcaspase-12表達(dá)增加，逐漸增高，至24達(dá)高峰(P<0.01)，72h仍維持在較高水平。
　　 4.應(yīng)用SP600125干預(yù)后，caspase-12在缺血再灌注腦組織的表達(dá)明顯低于無SP600125干預(yù)組(P<0.05)，高峰期不明顯(P>0.05)。
　　 5.DMSO組免疫熒光雙標(biāo)染色顯示，再灌注6h可見GADD153、caspase-12單標(biāo)及雙標(biāo)陽(yáng)性細(xì)胞，主要位于紋狀體區(qū)；12～24

10、h二者單標(biāo)及雙標(biāo)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)均明顯增多(P<0.05)，主要位于紋狀體區(qū)，皮層區(qū)也可見少量表達(dá)；至72h，GADD153單標(biāo)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)減少，caspase-12單標(biāo)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)仍較多，雙標(biāo)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)減少(P<0.05)。
　　 6.與DMSO組比較，SP組GADD153單標(biāo)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)略有減少，caspase-12單標(biāo)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)及雙標(biāo)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯減少(P<0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1.GADD153和casp