人食管癌引流淋巴結(jié)細(xì)胞的培養(yǎng)及抑瘤試驗(yàn).pdf

1、食管癌是嚴(yán)重威脅我國人民健康的惡性腫瘤。經(jīng)過多年的研究，食管癌的手術(shù)后五年生存率仍然維持在20％～30％左右。免疫治療已成為繼手術(shù)、放療、化療之后最有希望提高生存率和生活質(zhì)量的方法。過繼性細(xì)胞免疫治療(Adoptivecellularimmunotherapy，ACI)是目前主要的免疫療法之一?？捎糜谶^繼性細(xì)胞免疫治療的細(xì)胞種類主要有LAK細(xì)胞、腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞(TIL)、細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)等。CTL的主要來源有外周血單個(gè)核細(xì)

2、胞、TIL及腫瘤引流淋巴結(jié)(TDLN)。樹突狀細(xì)胞(DC)以其強(qiáng)大的抗原提呈作用在過繼免疫治療中占有重要地位。TDLN中含有大量DC和T淋巴細(xì)胞。這些細(xì)胞在體內(nèi)長期接受腫瘤抗原的刺激，具有對(duì)腫瘤的特異性和敏感性，但由于在體內(nèi)受到腫瘤的抑制，無法發(fā)揮正常功能。本試驗(yàn)采用體外培養(yǎng)TDLN細(xì)胞，恢復(fù)DC和T淋巴細(xì)胞的活性，擴(kuò)增其數(shù)量，研究TDLN細(xì)胞對(duì)自體瘤細(xì)胞殺傷作用。 方法：第一部分：術(shù)中切取食管癌無轉(zhuǎn)移引流淋巴結(jié)2～4枚，獲取單

3、個(gè)核細(xì)胞，懸于30ml含IL-2175U/ml(I-TDLN組)或IL-2175U/ml，IL-4500U/ml，GM-CSF100U/ml(G-TDLN組)的RPMI1640培養(yǎng)基中，置于飽和濕度、37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化；測(cè)定培養(yǎng)第7天、第14天、第21天收獲細(xì)胞數(shù)；采用流式細(xì)胞技術(shù)(FCM)檢測(cè)第14天時(shí)收獲細(xì)胞中CD3+、CD8+、CD4+、CD56+、CD83+細(xì)胞的比例；采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(E

4、nzyme-linkedimmunoabsorbentassay，ELISA)檢測(cè)培養(yǎng)上清液中第7天、第14天、第21天IL-12、IFN-γ和TNF-α的含量；采用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)收獲細(xì)胞的DNA倍體情況。第二部分：利用外周血淋巴細(xì)胞培養(yǎng)獲得LAK細(xì)胞，采用MTT法對(duì)比LAK細(xì)胞、I-TDLN細(xì)胞和G-TDLN細(xì)胞對(duì)自體瘤細(xì)胞和人食管癌細(xì)胞株TE-13細(xì)胞的殺傷率。第三部分：術(shù)中切取食管癌腫瘤組織塊。將其切成1mm3接種到30只3～4

5、周齡BLAB/C裸鼠腋背部皮下建立荷瘤裸鼠模型。一周后隨機(jī)分為五組：空白對(duì)照組、IL-2治療組、LAK細(xì)胞組、I-TDLN細(xì)胞組、G-TDLN細(xì)胞組，分別注射生理鹽水0.2ml；IL-21000u/ml0.2ml；LAK細(xì)胞2×107/ml0.2ml+IL-21000u/ml0.2ml；I-TDLN細(xì)胞2×107/ml0.2ml+IL-21000u/ml0.2ml；G-TDLN細(xì)胞2×107/ml0.2ml+IL-21000u/ml0.

6、2ml。除空白對(duì)照組外，其他各組每只裸鼠每3天局部注射IL-21000u/ml0.2ml一次。測(cè)量記錄腫瘤的最長徑(a)和最短徑(b)，按體積(V)=πab2/6計(jì)算腫瘤體積；計(jì)算抑瘤率；HE染色觀察腫瘤細(xì)胞形態(tài)，免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)瘤組織中T細(xì)胞和DC浸潤情況，利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)移植瘤腫瘤細(xì)胞凋亡率和Fas、Fasl、Bax、Bcl-2和Survivin蛋白的表達(dá)。 結(jié)果：1.TDLN的細(xì)胞學(xué)形態(tài)：培養(yǎng)5～7天時(shí)有細(xì)胞群落形成

7、；免疫熒光染色顯示細(xì)胞群落中既有淋巴細(xì)胞也有DC。2.細(xì)胞生長情況：1.0克淋巴組織在培養(yǎng)的第7天、第14天、第21天獲得的細(xì)胞數(shù)(×108)分別為：I-TDLN組，1.00±0.35(第7天)、1.37±0.25(第14天)、1.18±0.28(第21天)；G-TDLN組，1.02±0.4(第7天)、1.41±0.39(第14天)、1.21±0.39(第21天)。重復(fù)測(cè)量方差分析顯示兩組間差異不顯著(F=3.384，P=0.96)；I

8、-TDLN組收獲細(xì)胞數(shù)在第7天、第14天、第21天間存在顯著差異，其中第14天細(xì)胞明顯多于第7天和第21天(P＜0.001)；G-TDLN組收獲細(xì)胞數(shù)在第7天、第14天、第21天間存在顯著差異，其中第14天細(xì)胞明顯多于第7天和第21天(P＜0.001)。3.TDLN細(xì)胞的免疫表型分析：TDLN細(xì)胞表型分析結(jié)果顯示，TDLN細(xì)胞主要由CD3+T細(xì)胞和CD83+成熟樹突狀細(xì)胞組成。I-TDLN組收獲的細(xì)胞中CD3+、CD4+、CD8+、CD

9、56+、CD83+的比例分別為81.7％±5.5％、49.7％±4.2％、30.3％±7.5％、8.8％±3.1％、20.1％±4.7％；G-TDLN組收獲的細(xì)胞中CD3+、CD4+、CD8+、CD56+、CD83+的比例分別為83.3％±3.6％、42.4％±4.8％、38.8％±3.1％、9.5％±3.0％、30.8％±2.1％。G-TDLN組CD4+、CD8+、CD83+比例與I-TDLN組存在顯著差異(P＜0.05)。4.培養(yǎng)上

10、清液中細(xì)胞因子的檢測(cè)：①I-TDLN組上清液中TNF-α的含量(ng/m1)在培養(yǎng)第7天、第14天、第21天時(shí)分別為59.7±17.7、62.3±12.2、55.1±10.4；G-TDLN組上清液中TNF-α的含量在培養(yǎng)第7天、第14天、第21天時(shí)分別為55.3±13.2、61.2±7.6、56.9±5.1。重復(fù)測(cè)量方差分析顯示兩組間TNF-α的含量無顯著差異(F=0.045，P=0.836)；I-TDLN組上清液中TNF-α的含量在培

11、養(yǎng)第7天、第14天、第21天無明顯差異；G-TDLN組上清液中TNF-α的含量在培養(yǎng)第7天、第14天、第21天無顯著差別。②I-TDLN組上清液中IFN-γ的含量(ng/m1)在培養(yǎng)第7天、第14天、第21天時(shí)分別為36.3±5.0、47.5±5.1、45.3±3.8；G-TDLN組上清液中IFN-γ的含量在培養(yǎng)第7天、第14天、第21天時(shí)分別為55.1±3.8、62.3±5.9、58.8±6.1。重復(fù)測(cè)量方差分析顯示兩組間IFN-γ的

12、含量差異顯著(F=55.757，P＜0.001)，I-TDLN組上清液中IFN-γ的含量明顯低于G-TDLN組；I-TDLN組上清液中IFN-γ的含量在培養(yǎng)第14天、第21天明顯高于第7天時(shí)(P＜0.05)，第14天、第21天間無顯著差別；G-TDLN組上清液中IFN-γ的含量在培養(yǎng)第14天、第21天明顯高于第7天時(shí)(P＜0.05)，第14天、第21天間無顯著差別。③I-TDLN組上清液中IL-12的含量(mol/L)在培養(yǎng)第7天、第1

13、4天、第21天時(shí)分別為13.5±2.9、15.0±1.9、13.3±2.9；G-TDLN組上清液中IL-12的含量在培養(yǎng)第7天、第14天、第21天時(shí)分別為16.3±3.2、23.4±5.7、17.0±5.5。重復(fù)測(cè)量方差分析顯示兩組間IL-12的含量差異顯著(F=5.856，P=0.036)，I-TDLN組上清液中IL-12的含量明顯低于G-TDLN組；I-TDLN組上清液中IL-12的含量在培養(yǎng)第7天、第14天、第21天無顯著差別；G

14、-TDLN組上清液中IL-12的含量在培養(yǎng)第14天明顯高于第7天、第21天(P＜0.05)，第7天、第21天時(shí)無明顯差異。5.G-TDLN細(xì)胞和I-TDLN細(xì)胞中均未檢測(cè)到異倍體細(xì)胞。 結(jié)論： 1.通過對(duì)TDLN細(xì)胞的培養(yǎng)可以獲得大量成熟DC和T細(xì)胞。 2.在培養(yǎng)基中添加GM-CSF和IL-4可以收獲更多的成熟DC和CD8+T細(xì)胞。 3.培養(yǎng)第14天左右時(shí)細(xì)胞活性最強(qiáng)。 4.通過此方法收獲的TDL

15、N細(xì)胞中無癌細(xì)胞殘留。 5.I-TDLN和G-TDLN細(xì)胞對(duì)自體腫瘤細(xì)胞具有很強(qiáng)的殺傷活性，G-TDLN細(xì)胞強(qiáng)于I-TDLN細(xì)胞。 6.I-TDLN和G-TDLN細(xì)胞對(duì)自體腫瘤細(xì)胞的殺傷有特異性。 7.I-TDLN細(xì)胞和G-TDLN細(xì)胞對(duì)裸鼠移植瘤具有很強(qiáng)的殺傷活性，G-TDLN細(xì)胞強(qiáng)于I-TDLN細(xì)胞。 8.I-TDLN細(xì)胞和G-TDLN細(xì)胞能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，對(duì)腫瘤細(xì)胞的Bax/Bcl-2和Survi