移植部位及外源性促性腺激素對(duì)人胎兒卵巢組織異種移植后卵泡發(fā)育的影響.pdf

1、目的 半個(gè)世紀(jì)以來的研究已表明卵巢組織的冷凍保存和移植能恢復(fù)由于化療、放療或手術(shù)而面臨卵巢早衰的女性的生殖能力.隨著更多女性患者提出儲(chǔ)備生育力的要求,卵巢器官庫(kù)的建立將成為最終的目標(biāo).要實(shí)現(xiàn)該目標(biāo)需進(jìn)行大量相關(guān)的基礎(chǔ)研究和臨床研究,但由于成人卵巢組織來源有限,人們將眼光轉(zhuǎn)向胎兒卵巢組織.凍融后胎兒卵巢組織異種移植后在促卵泡生成素(FSH)作用下原始卵泡能發(fā)育到竇卵泡階段已見一些報(bào)道,但資料有限,諸多影響異種移植后組織中始基卵泡發(fā)

2、育的機(jī)制仍需進(jìn)一步研究闡明.本實(shí)驗(yàn)以去勢(shì)雌性裸鼠為受體,從光學(xué)顯微鏡、電子顯微鏡及增殖細(xì)胞核抗原表達(dá)等方面進(jìn)行評(píng)價(jià):1)程序冷凍法保存胎兒卵巢組織的有效性;2)外源性促性腺激素及移植部位對(duì)胎兒卵巢組織存活及卵泡發(fā)育的影響:通過以上研究為人胎兒卵巢組織作為潛在供體和臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù). 方法 一新鮮胎兒卵巢移植的實(shí)驗(yàn)研究實(shí)驗(yàn)動(dòng)物按回收移植物時(shí)期分為3組(分別為10-14w、18-22w、26-30w),每組4只,共12只

3、.移植術(shù)后1個(gè)月開始隔天經(jīng)腹腔注射孕馬血清促性腺激素(PMSG)5IU/只,分別在術(shù)后10-14w、18-22w、26-30w回收移植物.新鮮胎兒組織為對(duì)照組. 二凍融胎兒卵巢移植的實(shí)驗(yàn)研究實(shí)驗(yàn)動(dòng)物按不同PMSG作用時(shí)問分為3組:A組:移植術(shù)后1個(gè)月開始隔日經(jīng)腹腔注射PMSG 5IU至取材;B組:取材前14天開始隔日經(jīng)腹腔注射PMSG 5IU,共7次;C組(生理鹽水對(duì)照組):等量生理鹽水隔天經(jīng)腹腔注射至取材;每組6只,共18只.

4、移植術(shù)后26-30w回收移植物.新鮮的胎兒卵巢組織為新鮮組,慢凍-快融的胎兒卵巢組織為凍融組. 以上實(shí)驗(yàn)均選擇裸鼠左側(cè)背部皮下、右側(cè)腎被膜下作為移植部位,各移植2塊組織.各移植組按移植部位分為腎被膜下組和背部皮下組.取材前36小時(shí)經(jīng)腹腔注射人絨毛膜促性腺激素(HCG)5IU/只.所有胎兒卵巢組織石蠟包埋后5um連續(xù)切片,分別進(jìn)行光學(xué)顯微鏡和增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)的檢測(cè),新鮮組及凍融組同時(shí)進(jìn)行電子顯微鏡的檢測(cè). 結(jié)果

5、 一新鮮胎兒卵巢移植的實(shí)驗(yàn)研究 一) 動(dòng)物的存活及組織回收情況動(dòng)物存活率100﹪(12/12).腎被膜下移植物95.8﹪的回收率高于背部皮下組70.8﹪的回收率(P<0.05). 二)光學(xué)顯微鏡觀察與新鮮未移植胎兒卵巢組織相比,各時(shí)期移植組中各級(jí)卵泡形態(tài)基本完整,原始卵泡均顯著減少(P<0.05),生長(zhǎng)卵泡增加.移植術(shù)后10-14w及18-22w腎被膜下回收組織中原始卵泡數(shù)高于背部皮下組(P<0.05),但26-3

6、0w后兩組比較則無顯著差別.在PMSG作用下,術(shù)后10w移植物中見初級(jí)及次級(jí)卵泡,術(shù)后18w腎被膜下移植物始見竇卵泡. 二凍融胎兒卵巢移植的實(shí)驗(yàn)研究 1 新鮮組和凍融組的檢測(cè)胎兒卵巢皮質(zhì)中以原始卵泡為主,凍融組原始卵泡數(shù)較新鮮組減少(27.26±8.91～22.10±9.44),但比較無顯著差異.電鏡下觀察到凍融后卵巢組織中細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)大部分保存良好,卵母細(xì)胞及顆粒細(xì)胞冷凍損傷主要表現(xiàn)為線粒體水腫. 2 移植組

7、的檢測(cè) 1)動(dòng)物的存活及組織回收情況動(dòng)物存活率為100﹪(18/18).各PtISG作用時(shí)間組及生理鹽水對(duì)照組的組織回收率分別為91.7﹪、91.7﹪、83.3﹪,各組比較無顯著差異.腎被膜下組織回收率與背部皮下相比無顯著差別(94.4﹪～83.3﹪). 2)光學(xué)顯微鏡觀察與新鮮組及凍融組比較,各移植組原始卵泡數(shù)均顯著下降(P<0.05),生長(zhǎng)卵泡數(shù)增加,且均見竇卵泡及黃體組織.與生理鹽水對(duì)照組相比,PMSG作用A組腎被

8、膜下及皮下移植物中的原始卵泡數(shù)均較高(P<0.05),B組則無顯著差別.但A、B組相比較,B組腎被膜下移植物中的原始卵泡數(shù)顯著減少(P<0.05),皮下移植物則無顯著差異.各組中腎被膜下和背部皮下移植物的原始卵泡數(shù)及生長(zhǎng)卵泡數(shù)比較均無明顯差別. 三 PCNA的檢測(cè)對(duì)照組、新鮮組及冷凍組未見各卵泡中顆粒細(xì)胞PCNA的陽性表達(dá).偶見新鮮移植組中原始卵泡中體積增大、呈立方形的前顆粒細(xì)胞中有PCNA的陽性表達(dá),PCNA的陽性表達(dá)見于新鮮

9、及凍融移植物中的初級(jí)卵泡、次級(jí)卵泡、竇卵泡的顆粒細(xì)胞和/或卵母細(xì)胞中及黃體組織,卵巢間質(zhì)也存在PCNA的陽性表達(dá). 結(jié)論 1、凍融后人胎兒卵巢組織原始卵泡無明顯減少;組織學(xué)和超微結(jié)構(gòu)觀察顯示卵泡形態(tài)結(jié)構(gòu)保存良好;組織移植后卵泡可持續(xù)發(fā)育;以上均證明凍融后胎兒卵巢組織中原始卵泡保持形態(tài)和功能的完整,慢速冷凍法適合人胎兒卵巢組織的保存. 2、移植過程導(dǎo)致相當(dāng)數(shù)量的卵泡丟失,但仍有部分卵泡存活并發(fā)育到竇卵泡階段,且增殖