納米雄黃混懸液抗宮頸癌的實驗研究.pdf

1、本文主要從以下三個部分展開論述：
　　第一部分 納米雄黃混懸液的制備
　　目的:雄黃是我國的傳統(tǒng)中藥,它的主要成分為硫化砷(As4S4或As2S2),另外還含有少量三氧化二砷(As2O3)及五氧化二砷(As2O5)。由于雄黃在臨床上的特殊功效及其毒性反應,自古就很重視它的炮制處理。但雄黃難溶于水,胃腸道吸收差,生物利用度低,故臨床用藥劑量大,阻礙了雄黃的臨床應用推廣。目前,納米技術的發(fā)展,為我們優(yōu)化雄黃制劑提供了新的思路。我

2、們在前人研究的基礎上制備納米雄黃混懸液,為雄黃體外抗腫瘤研究提供實驗理論基礎。
　　方法:經去毒處理后按藥典規(guī)定方法測得 As4S4含量為92.3％的雄黃原料粉,經球磨機粉碎,將過500目篩的雄黃樣品3 g,加蒸餾水至300 mL,磁力攪拌器攪拌30 min,加入M-110EH型微射流制粒機30000rpm·min-1,10個循環(huán),最后1次5000rpm·min-1。超聲震蕩30 min,再過0.22μm微孔濾器除菌,密封避光4℃

3、保存。在Nicomp380 ZLS型粒度測定儀上測定粒度;采用砷鉬藍法測定樣品中的砷含量;繪制標準曲線,測定樣品中As2O3含量的變化;通過掃描電鏡觀察納米雄黃混懸液的微觀形貌。
　　結果:應用微射流法制備了平均粒徑為186.8 nm左右的納米雄黃混懸液,其砷含量為9.27 mg·g-1, As2O3含量為1.86 mg·g-1。密封避光4℃保存,在60d內 As2O3含量略有增加(1.86 mg·g-1增加到2.1mg·g-1)

4、。掃描電鏡觀察所得納米雄黃顆粒顆粒均勻分散,沒有發(fā)生團聚。說明納米雄黃混懸液在密封避光4℃的環(huán)境中具備一定的物理穩(wěn)定性。
　　結論:制備了物理及化學特性較穩(wěn)定的納米雄黃混懸液。
　　第二部分 宮頸癌SiHa細胞體外藥敏試驗
　　目的:探討納米雄黃混懸液體外對宮頸癌SiHa細胞、HeLa細胞、乳腺癌MCF-7細胞、肝癌HepG2細胞的抑制率,了解不同實體瘤細胞株對納米雄黃混懸液的敏感性。
　　方法:將納米雄黃混懸液

5、按倍比稀釋法配制成不同實驗濃度梯度的藥物(6.25,12.5,25,50 mg·L-1)作用于宮頸癌SiHa細胞、HeLa細胞、乳腺癌MCF-7細胞、肝癌HepG2細胞不同時間段(12,24,48,72 h)后,應用MTT比色法比較其對不同實體瘤細胞抑制率的影響,并應用 Bliss法計算納米雄黃混懸液對不同腫瘤細胞的半數有效濃度(IC50),檢測不同實體瘤細胞株對納米雄黃混懸液的敏感性。
　　結果:MTT比色法顯示,納米雄黃混懸液

6、對宮頸癌SiHa細胞、HeLa細胞、乳腺癌MCF-7細胞、肝癌HepG2細胞均有抑制作用,均呈時間-劑量依賴關系,與對照組比較有顯著統(tǒng)計學意義(P<0.05);用Bliss法計算納米雄黃混懸液對四株細胞的IC50值,結果分別為18.71 mg·L-1,38.95 mg·L-1,26.14mg·L-1和64.01 mg·L-1,由此可見,納米雄黃混懸液抑制SihHa細胞增殖的作用最強。
　　結論:對納米雄黃混懸液的敏感度從高到低依次

7、為宮頸癌SiHa細胞、乳腺癌MCF-7細胞、宮頸癌HeLa細胞、肝癌HepG2細胞。
　　第三部分 納米雄黃混懸液誘導宮頸癌SiHa細胞凋亡機制的初步探討
　　第一節(jié) 宮頸癌中RCAS1表達與HPV16E6、HPV16E7表達的關系研究
　　目的:探討宮頸癌中RCAS1蛋白表達與HPV16E6、HPV16E7蛋白表達的關系,為進一步研究HPV感染的免疫逃逸機制提供理論依據。
　　方法:1.采用免疫組化S-P(st

8、reptavidin-peroxidase)法,分別檢測71例宮頸癌,76例子宮頸上皮內瘤樣病變(CIN)及20例正常宮頸組織中RCAS1蛋白與HPV16 E6、E7蛋白的表達,并分析其相關性。
　　2.Western Blot檢測宮頸癌SiHa細胞中RCAS1蛋白與HPV16 E6、E7蛋白的表達。
　　結果:1. RCAS1蛋白主要表達于癌細胞膜和/或細胞漿,從正常宮頸組織到CIN再到宮頸癌組織,RCAS1蛋白的陽性表達

9、率分別為0、39.47%和77.46%,提示隨著宮頸病變惡性程度的進展RCAS1表達逐漸增強(P<0.05)。低分化宮頸癌組中RCAS1陽性表達顯著高于高、中分化宮頸癌組(P<0.01);但與患者年齡、臨床分期及組織學分型無關(P>0.05)。
　　2.HPV16 E6蛋白主要表達于癌細胞核,從正常宮頸組織到CIN再到宮頸癌組織, HPV16 E6蛋白的陽性表達率分別為10%、35.53%和60.56%,提示隨著宮頸病變惡性程度的

10、進展HPV16 E6表達逐漸增強(P<0.05)。HPV16 E6陽性表達在低分化宮頸癌組中顯著高于高、中分化宮頸癌組(P<0.01);但與患者年齡、臨床分期、組織學分型無關(P>0.05)。
　　3.HPV16 E7蛋白主要表達于癌細胞核,從正常宮頸組織到CIN再到宮頸癌組織, HPV16 E7蛋白的陽性表達率分別為5%、28.94%和61.97%,提示隨著宮頸病變惡性程度的進展HPV16 E7表達均逐漸增強(P<0.05)。H

11、PV16 E7在鱗癌組中的陽性表達顯著高于腺癌組(P<0.01);但與患者年齡、臨床分期、組織學分級無關(P>0.05)。
　　4.宮頸病變組織中RCAS1蛋白的異常表達與HPV16E7蛋白陽性表達呈正相關(P<0.01),與HPV16E6蛋白陽性表達呈正相關(P<0.01)。
　　5.通過Western Blot均檢測到宮頸癌SiHa細胞中HPV16E6、E7蛋白及RCAS1蛋白的表達。
　　結論:RCAS1蛋白在宮

12、頸癌組織中表達增強,RCAS1表達強度與宮頸癌惡性程度相關;RCAS1陽性的宮頸癌組織中存在HPV16感染。宮頸癌SiHa細胞中存在RCAS1蛋白和HPV16E6、E7蛋白的表達。
　　第二節(jié) 納米雄黃混懸液誘導宮頸癌SiHa凋亡及對HPV16E6、E7和RCAS1表達的影響
　　目的:初步探討納米雄黃混懸液誘導宮頸癌SiHa細胞凋亡的機制及HPV16E6、E7和RCAS1表達的影響。從一個新的角度對 HPV病毒的生物學性狀

13、進行研究,為宮頸癌的臨床預防、治療提供理論依據。
　　方法:將不同質量濃度的納米雄黃混懸液(6.25,12.5,25,50 mg·L-1)作用于宮頸癌SiHa細胞不同時間段(12,24,48,72 h),通過光鏡和透射電鏡觀察實驗組(不同質量濃度的納米雄黃混懸液處理組)和對照組(不加藥物的細胞)細胞的形態(tài)學變化;吖啶橙染色檢測凋亡細胞;瓊脂糖凝膠電泳觀察凋亡細胞DNA Ladder形成;流式細胞儀檢測細胞凋亡率及細胞周期改變;用R

14、T-PCR方法檢測Bcl-2、Bax、HPV16 E6、E7和RCAS1mRNA的表達;用 Western Blot方法檢測HPV16 E6、E7和RCAS1蛋白表達量的變化?？疾旒{米雄黃混懸液對宮頸癌SiHa細胞的凋亡誘導效應。
　　結果:1.納米雄黃混懸液25,50 mg·L-1處理SiHa細胞48 h后,細胞存活率明顯降低,凋亡增加,電鏡顯示細胞呈典型的凋亡形態(tài)學改變;細胞進行吖啶橙染色后大多表現為凋亡樣變化;瓊脂糖凝膠電泳

15、顯示凋亡細胞DNA Ladder形成;流式細胞術檢測表明納米雄黃混懸液致細胞凋亡呈濃度依賴性,與對照組相比,差異有極顯著意義(P<0.01),且細胞呈G0/G1期阻滯。
　　2. RT-PCR檢測結果顯示,納米雄黃混懸液25,50 mg·L-1處理SiHa細胞48,72 h后,宮頸癌SiHa細胞中Bcl-2、HPV16 E6、E7和RCAS1 mRNA的表達不同程度地受到抑制,而Bax mRNA的表達明顯升高,與正常對照組比較,均

16、有顯著統(tǒng)計學差異(P<0.01)。而納米雄黃混懸液6.25,12.5 mg·L-1組,上述表現與正常對照組比較無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。
　　3. Western Blot檢測結果顯示,納米雄黃混懸液25,50 mg·L-1處理SiHa細胞48,72 h后,宮頸癌SiHa細胞中HPV16 E6、E7和RCAS1蛋白表達亦不同程度地受到抑制,與對照組比較有顯著統(tǒng)計學差異(P<0.01),而納米雄黃混懸液6.25,12.5 mg·