LPS致早期新生鼠腦白質損傷中TLR4、TNF-α表達及倍他米松的保護作用.pdf

1、目的:早產兒腦白質損傷(WMD)是極低出生體重兒腦損傷的主要形式，發(fā)病率高且預后差。目前認為宮內感染、炎癥反應是導致早產兒WMD的重要因素。國外已有研究證實WMD發(fā)生于髓鞘形成的高峰期，少突膠質前體細胞(preOL)是WMD的靶細胞。該研究通過向2日齡(P2)新生鼠腹腔注射不同劑量的脂多糖(LPS)，動態(tài)觀察新生鼠腦白質區(qū)病理改變和細胞凋亡的變化，以及髓鞘發(fā)育的情況，制備出WMD的動物模型；分別采用形態(tài)學、分子生物學方法檢測腦組織中TL

2、R4及TNF-α表達的變化并探討其與損傷的關系；以腦發(fā)育相對成熟的7日齡(P7)新生鼠作為對照，研究LPS對不同成熟程度腦白質的影響；并探討不同劑量、不同時間注射倍他米松(Beta)對WMD是否具有保護作用。 方法: 分別向隨機分組的P2新生鼠腹腔注射藥物：A組注射LPS(A1組1.0mg/kg、A2組2.5mg/kg、A3組5.0mg/kg)；B組為Beta干預組(B1組在注射LPS5.0mg/kg的同時注射Beta2

3、.0mg/kg，B2、B3組分別在注射LPS5.0mg/kg前16小時注射Beta2.0mg/kg、4.0mg/kg)；C組向P7新生鼠注射LPS5.0mg/kg；D組為鹽水對照組，向P2新生鼠腹腔注射無菌鹽溶液。采用HE染色檢測各組新生鼠注藥后24h、P14時腦白質區(qū)病理變化，原位末端標記法(Tunel)檢測給藥后24h腦白質區(qū)細胞凋亡的變化；免疫組化法檢測各組給藥后24hCNPase表達的變化及P14時MBP表達的變化；免疫組化法及

4、反轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)法觀察A3組新生鼠注藥后1h、2h、3h、4h、6h腦組織內TLR4及TNF-α表達的變化，不同劑量LPS給藥后2h時TLR4和4h時TNF-α表達的變化。 結果: ① 給藥后24h，A3組新生鼠12.5％(1/8)死亡，存活者28.6％(2/7)可見胼胝體區(qū)、外囊區(qū)灶性出血和/或側腦室內出血，B1組可見外囊區(qū)灶性出血，甚至皮層、皮層下白質、尾狀核區(qū)可見大量的點片狀出血；P14時A3組胼

5、胝體區(qū)可見軟化灶，軟化灶的周圍有膠質細胞的增生，其他組則無明顯病理改變。 ② 注藥后24h胼胝體區(qū)可見棕褐色核染的凋亡細胞，A1組與對照組相比無差異，隨著LPS劑量的增加，凋亡細胞百分比逐漸增加，與對照組相比，A2組凋亡細胞百分比增加(6.38±0.74vs4.88±1.25，P＜0.05)，A3組差異更為顯著(21.43±1.72vs4.88±1.25，P＜0.01)；與A3組相比，B1組凋亡細胞百分比增高(23.13±1.1

6、3vs21.43±1.72，P＜0.05)，而提前給予Beta的B2、B3組凋亡細胞百分比明顯減少，且隨著Beta劑量的增加，凋亡細胞百分比也明顯減少(13.63±1.06vs21.43±1.72，P＜0.01；5.63±1.06vs21.43±1.72，P＜0.01)；與A3組相比，C組凋亡細胞百分比明顯減少(8.75±1.28vs21.43±1.72，P＜0.01)。 ③ 給藥后24h，腦室周圍白質區(qū)中可檢測到胞漿及突起CN

7、Pase陽性染色的未成熟少突膠質細胞，A1組與D組無明顯差異(P＞0.05)，但隨著LPS劑量的增加，染色逐漸變淡(P＜0.01)；與A3組相比，B1組染色更淡，而B2、B3組則染色加深，且隨著Beta劑量的增加，染色更深(P＜0.01)。 ④ P14時，在胼胝體、放射冠和內、外囊白質束可以清楚地檢測到MBP陽性染色，A1、A2組與D組相比無明顯差異(P＞0.05)，隨著LPS劑量的增加，A3組MBP染色明顯減少(P＜0.01)

8、；與A3組相比，B1組無明顯改變(P＞0.05)，而B2、B3組染色加深，且隨著Beta劑量的增加，染色更深，C組也較A3組染色明顯加深(P＜0.01)。 ⑤ 腦組織中脈絡叢、軟腦膜及胼胝體區(qū)細胞胞漿中有不同程度的TLR4陽性表達，與對照組相比，A3組給藥后1h即有TLR4表達減低(P＜0.05)，2h達最低值(P＜0.01)，3h后表達漸增強，但仍低于對照組(P＜0.01)，4h恢復到原來的水平；給藥后2h，A1組與對照組均可

9、見較多TLR4陽性細胞表達，兩者無差異(P＞0.05)，隨著LPS的劑量的增加，A2、A3組TLR4陽性表達逐漸減低(P＜0.01)，且隨著LPS劑量的增加降低更明顯(P＜0.01)；與A3組相比，B1組給藥后2h，TLR4表達無明顯變化或表達減低，而B2、B3組TLR4表達增強(P＜0.01)，且隨著Beta劑量的增加TLR4的表達增加越明顯；C組給藥后2hTLR4的表達高于A3組(P＜0.01)。 ⑥ 與對照組相比，A3組注

10、藥后腦組織內TNF-α陽性染色細胞逐漸加深，且面積增大，4h達高峰，此后緩慢下降；新生鼠注射不同劑量的LPS后4h，A1組腦組織中僅見少量TNF-α陽性表達，與對照組無差異(P＞0.05)，而隨著LPS劑量的增加，TNF-α陽性染色逐漸增加(P＜0.01)。與A3組相比，B1組給藥后4h，TNF-α表達增加(P＜0.05)，而B2、B3組TNF-α表達減低(P＜0.01)，且隨著Beta劑量的增加TNF-α的表達減低越明顯；C組給藥后4

11、hTNF-α的表達低于A3組(P＜0.01)。 結論: 新生鼠腹腔注射一定劑量的LPS可使腦白質區(qū)發(fā)生出血、軟化和凋亡細胞增加，髓鞘發(fā)育延遲或髓鞘損傷，從而導致WMD；TLR4是LPS致新生鼠WMD的重要受體，TNF-α是WMD發(fā)生中重要的細胞因子，他們可以反映WMD的程度；WMD的發(fā)生與腦的成熟程度密切相關；提前給予Beta可抑制LPS所致的TLR4表達降低，降低TNF-α的表達，減少腦白質區(qū)細胞凋亡，促進髓鞘發(fā)育成熟