新型含鍶硫酸鈣的生物相容性試驗(yàn).pdf

1、在開放性骨折、良性或惡性骨腫瘤、脛骨平臺(tái)壓縮性骨折等骨科手術(shù)的處理過程中，骨科醫(yī)師經(jīng)常會(huì)遇到骨缺損這一難題。進(jìn)行骨移植是解決這一問題的一項(xiàng)很常見的操作。自體骨移植是目前臨床上解決骨缺損問題的金標(biāo)準(zhǔn)。自體骨移植的特點(diǎn)是具有良好的骨誘導(dǎo)性、成骨特性及骨傳導(dǎo)性。如何使硫酸鈣在保留原有特性的同時(shí)又具有骨誘導(dǎo)性是近年來的研究熱點(diǎn)。鍶對骨的再生有益，它在促進(jìn)成骨的同時(shí)又能抑制破骨，展現(xiàn)出了良好的骨誘導(dǎo)性[6]。摻鍶硫酸鈣的制備早有報(bào)道，但是之前的研

2、究為含鍶化合物與硫酸鈣的物理混合，無法保證產(chǎn)品在微觀水平的絕對均一性[7]。我們設(shè)想的實(shí)驗(yàn)?zāi)康脑谟谔接懖捎盟疅岱ㄖ苽湟环N新型的摻鍶硫酸鈣可達(dá)到完全均質(zhì)性，并進(jìn)行生物相容性檢測，滿足臨床需要。依據(jù)GB/T16886.1-2011[8]，我們選擇了遲發(fā)性超敏試驗(yàn)、細(xì)胞毒性試驗(yàn)、皮內(nèi)刺激試驗(yàn)、急性全身毒性試驗(yàn)、亞急性全身毒性試驗(yàn)、肌肉內(nèi)植入試驗(yàn)、紅細(xì)胞微核試驗(yàn)共七項(xiàng)相關(guān)試驗(yàn)進(jìn)行生物相容性評估。
　　第一章 新型含鍶硫酸鈣的制備
　

3、　目的:制備一種新型的摻鍶硫酸鈣。
　　材料與方法:(1)共沉淀法制備含鍶的二水硫酸鈣
　　將含有氫氧化鈣和氫氧化鍶的化合物按9∶1的摩爾比進(jìn)行混合，加入去離子水制成水溶液，然后將含混合液的燒杯放置于磁力攪拌器上，再將稀硫酸加入前述混合液中，滴入過程中保持30℃加熱、持續(xù)攪拌，滴入完畢后維持加熱及攪拌3小時(shí)。生成的沉淀經(jīng)過濾、洗滌及干燥后，制成一定比例的含鍶二水硫酸鈣。方程式如下:
　　Ca(OH)2+H2SO4=Ca

4、SO4↓+2H2O Sr(OH)2+H2SO4=SrSO4↓+2H2O
　　(2)水熱法制備含鍶的α-半水硫酸鈣
　　將步驟1生成的產(chǎn)物按一定液固比與去離子水進(jìn)行混合，利用水熱反應(yīng)釜在一定溫度下反應(yīng)6小時(shí)，后趁熱將沉淀進(jìn)行過濾、洗滌、干燥及球磨，即制得含鍶α-半水硫酸鈣。結(jié)果評價(jià):制得粉末進(jìn)行X線衍射、傅里葉變換紅外光譜及差式量熱掃描表征檢測，證明所制備產(chǎn)物為含鍶α-半水硫酸鈣。
　　結(jié)果:X線衍射結(jié)果示:于14.63

5、°，25.72°和29.80°處可見α-半水硫酸鈣的特征三強(qiáng)峰，而在24.78°處可見鍶元素的特征峰;傅里葉變換紅外光譜與α-半水硫酸鈣標(biāo)準(zhǔn)圖譜相似，說明制備過程中鍶元素的加入并未影響α-半水硫酸鈣特有的性質(zhì)。差式量熱掃描結(jié)果，制備材料中結(jié)構(gòu)水含量為6.03％，與單純?chǔ)?半水硫酸鈣的6.20％相類似。如圖所示，于146.37℃處可見吸熱峰，而放熱峰位于174.64℃處，進(jìn)一步證實(shí)了制備材料具備α-半水硫酸鈣的性質(zhì)。
　　結(jié)論:成功

6、制備了含鍶硫酸鈣。
　　第二章 皮內(nèi)刺激反應(yīng)試驗(yàn)
　　目的:評價(jià)被試材料是否有潛在急性毒性刺激反應(yīng)。
　　材料與方法:在每只兔脊柱一側(cè)的5個(gè)點(diǎn)皮內(nèi)注射0.2mL用極性溶劑制備的浸提液。同樣在每只兔脊柱同一側(cè)的后五個(gè)點(diǎn)皮內(nèi)注射0.2mL極性溶劑對照液，在每只兔脊柱另一側(cè)注射用非極性溶劑制備的浸提液和非極性溶劑對照液，操作步驟同上。
　　結(jié)果:(1)極性浸提液組與極性溶劑對照組在24h、48h、72h三個(gè)時(shí)間點(diǎn)均未見

7、紅斑、水腫和潰瘍反應(yīng)，原發(fā)性刺激評分為0。(2)非極性浸提液組與非極性溶劑對照組在三個(gè)時(shí)間點(diǎn)可見有紅斑，但浸提液組紅斑范圍并未超過溶劑對照組;同時(shí)兩組均未見水腫。
　　結(jié)論:可以認(rèn)為該材料的皮內(nèi)刺激反應(yīng)為陰性。
　　第三章 遲發(fā)型超敏反應(yīng)試驗(yàn)
　　目的:評價(jià)被試材料是否具有引發(fā)遲發(fā)型超敏反應(yīng)的潛能。
　　材料與方法:本試驗(yàn)采用最大劑量致敏試驗(yàn)，試驗(yàn)流程主要包括三個(gè)階段:皮內(nèi)誘導(dǎo)階段、局部誘導(dǎo)階段、激發(fā)階段。

8、>　　結(jié)果:根據(jù)Magnusson和Kligman評級標(biāo)準(zhǔn)，實(shí)驗(yàn)組及對照組所用動(dòng)物評級均為0級。
　　結(jié)論:該材料不會(huì)引起遲發(fā)型超敏反應(yīng)。
　　第四章 體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)
　　目的:將浸提液加入L-929細(xì)胞中以評估其對細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變及毒性。
　　材料和方法:試驗(yàn)使用L929系細(xì)胞株（標(biāo)準(zhǔn)推薦），配制1×105/mL的L929細(xì)胞懸液接種于96孔培養(yǎng)板，每孔接種100μ L。置于培養(yǎng)箱(37℃，5％CO2)培養(yǎng)24

9、小時(shí)，待細(xì)胞大部分貼壁后，棄原培養(yǎng)基，用PBS液洗滌2次。實(shí)驗(yàn)組分別為100μ L的100％、75％、50％、25％浸提液，陰性對照組為100μL相應(yīng)的對照液，陽性對照組為100μL的0.64％苯酚溶液，每組18個(gè)復(fù)孔。分別于培養(yǎng)24小時(shí)、48小時(shí)及72小時(shí)后取各組6孔進(jìn)行MTT實(shí)驗(yàn)。在各觀察期，棄去原培養(yǎng)液，然后加入MTT溶液20μL，37℃下繼續(xù)孵育4小時(shí)后終止培養(yǎng)，吸去上清液，每孔加入150μ L二甲基亞砜(DMSO)，振蕩10m

10、in，用酶標(biāo)儀在490nm波長下測定其光吸收值(A490)，每孔測量3次，取其平均值作為其吸光值結(jié)果。
　　結(jié)果:(1)各實(shí)驗(yàn)組不同時(shí)間的細(xì)胞增殖率:隨著時(shí)間的增加，各實(shí)驗(yàn)組A490呈現(xiàn)增大的趨勢，各實(shí)驗(yàn)組與陰性對照組A490值比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。(2)細(xì)胞毒性評價(jià):實(shí)驗(yàn)組、陰性對照組不同時(shí)間點(diǎn)的毒性反應(yīng)均為Ⅰ級，無細(xì)胞毒性;而陽性對照組毒性反應(yīng)均為Ⅳ級，有細(xì)胞毒性。
　　結(jié)論:在本次試驗(yàn)條件下，被試材料的

11、細(xì)胞毒性試驗(yàn)為無細(xì)胞毒性，符合國家標(biāo)準(zhǔn)。
　　第五章 急性全身毒性試驗(yàn)
　　目的:評估該材料是否引起急性全身毒性。
　　材料與方法:取SPF昆明小鼠12只，雌雄各半，隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對照組，實(shí)驗(yàn)組6只，對照組6只。腹部常規(guī)安爾碘消毒后，用一次性注射器分別向?qū)嶒?yàn)組小鼠腹腔內(nèi)注50ml/kg體重劑量的浸提液一次，對照組小鼠注射50ml/kg體重劑量的生理鹽水一次。
　　結(jié)果:(1)在注射后當(dāng)時(shí)實(shí)驗(yàn)組、對照組所有動(dòng)物均

12、未出現(xiàn)不適癥狀，實(shí)驗(yàn)組與對照組無明顯差異。(2)所有小鼠體重都呈增加趨勢。對體重增加量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析（t檢驗(yàn)），可見三個(gè)時(shí)間點(diǎn)的P值均大于0.05。
　　結(jié)論:說明被試材料浸提液在短期內(nèi)無潛在毒性，可以認(rèn)為該材料的急性全身毒性實(shí)驗(yàn)符合實(shí)驗(yàn)要求。
　　第六章 亞急性全身毒性試驗(yàn)
　　目的:評估材料是否有潛在亞急性毒性反應(yīng)。
　　材料與方法:取SPF級昆明小鼠20只，雌雄各半，隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對照組，實(shí)驗(yàn)組10只，對

13、照組10只。腹部常規(guī)安爾碘消毒后，用一次性注射器分別向?qū)嶒?yàn)組小鼠腹腔內(nèi)注50ml/kg體重劑量的浸提液一次，對照組小鼠注射50ml/kg體重劑量的生理鹽水一次。重復(fù)相同操作，連續(xù)注射14天。
　　結(jié)果:(1)體重變化結(jié)果:浸提液注射后，所有小鼠體重呈增加趨勢，與對照組小鼠體重的增長相比，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。(2)臨床觀察方面，實(shí)驗(yàn)組及對照組均未出現(xiàn)異常情況，無紅斑、水腫出現(xiàn)。(3)臨床病理學(xué)檢查結(jié)果:測定紅細(xì)胞數(shù)(RBC)、白細(xì)胞數(shù)(W

14、BC)、血小板數(shù)(PLT)、血紅蛋白濃度(HGB)、紅細(xì)胞壓積(HCT)和平均紅細(xì)胞體積(MCV)。實(shí)驗(yàn)組與對照組雌、雄分別對比，所測六項(xiàng)指標(biāo)均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。測定天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)換酶(AST)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)換酶(ALT)、尿素氮(BUN)、總蛋白(TP)、血糖(GLU)、肌酐(CRE)、總膽固醇(T-CHO)、甘油三酯(TG)等血清生化學(xué)指標(biāo)。實(shí)驗(yàn)組與對照組雌、雄分別相比，所測定的八項(xiàng)生化指標(biāo)均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。(4)實(shí)驗(yàn)組和對照組在器官體

15、重上無明顯差異。心、肝、脾、肺、腎的病理切片上未觀察到炎癥或組織壞死現(xiàn)象。
　　結(jié)論:五個(gè)方面的評價(jià)結(jié)果表明被試材料浸提液在長期反復(fù)接觸時(shí)不會(huì)引起全身毒性。
　　第七章 哺乳動(dòng)物紅細(xì)胞微核實(shí)驗(yàn)
　　目的:測試被試材料的潛在致突變性。
　　材料與方法:對實(shí)驗(yàn)組及陰性對照組所有動(dòng)物分別按20ml/kg腹腔注射被試材料浸提液、0.9％生理鹽水;陽性對照動(dòng)物注射環(huán)磷酰胺溶液，注射劑量為40mg/kg體重。試驗(yàn)時(shí)注意，每天

16、注射時(shí)，應(yīng)使所有動(dòng)物幾乎同步被注射。第二次染毒在第一次染毒后，間隔24小時(shí)再次染毒，注射劑量及方法同第一次染毒。
　　結(jié)果:(1)毒性表現(xiàn)觀察:實(shí)驗(yàn)組及對照組動(dòng)物在接受不同處理后呼吸、進(jìn)食、尿便排泄等一般狀態(tài)正常，無嘔吐、驚厥、步態(tài)失穩(wěn)、呼吸抑制等中毒表現(xiàn)，所用動(dòng)物均未死亡或垂死，未觀察到毒性表現(xiàn)。(2)實(shí)驗(yàn)組嗜多染紅細(xì)胞在總紅細(xì)胞中比例不低于對照組的20％，符合實(shí)驗(yàn)要求;(3)與陰性對照組相比，實(shí)驗(yàn)組微核率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而陽

17、性對照組微核率差異有顯著性意義
　　結(jié)論:該實(shí)驗(yàn)條件下被試材料的浸提液對小鼠不會(huì)產(chǎn)生遺傳毒性，即沒有致突變作用。
　　第八章 肌肉內(nèi)植入試驗(yàn)
　　目的:植入后局部反應(yīng)試驗(yàn)是評價(jià)生物材料和制品對活體組織的局部毒性作用。
　　材料與方法:以2 ml/Kg注射量將3％戊巴比妥鈉溶液腹腔注射注射麻醉，在大鼠脊柱中線兩側(cè)約lcm處各選1個(gè)植入點(diǎn)，分離肌肉形成肌腔隙，植入被試材料（高10mm，直徑3 mm圓柱體），每側(cè)各植入

18、1個(gè)，右側(cè)植入實(shí)驗(yàn)組（含鍶硫酸鈣），左側(cè)作為空白對照組（切開但不植入），術(shù)后動(dòng)物連續(xù)3天肌注青霉素預(yù)防感染。
　　結(jié)果:(1)整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中，沒有出現(xiàn)排斥反應(yīng)和全身毒性反應(yīng)，動(dòng)物術(shù)后第二天就活動(dòng)自如，觀察期內(nèi)無任一動(dòng)物死亡。(2)術(shù)后1周，炎性細(xì)胞反應(yīng)程度為Ⅳ級，囊壁形成0級;術(shù)后4周，炎性細(xì)胞反應(yīng)程度為Ⅱ級，囊壁形成為Ⅱ級;術(shù)后12周，炎性細(xì)胞反應(yīng)程度為Ⅰ級，囊壁形成為Ⅰ級。
　　結(jié)論:試驗(yàn)系統(tǒng)下該材料不存在潛在肌肉毒性。