熒光PEG-PAMAM-Tf-Dbait靶向遞釋系統(tǒng)的構(gòu)建及其血腦屏障通透性的研究.pdf

1、目的：構(gòu)建Tf修飾的靶向血腦屏障的熒光PEG-PAMAM-Tf/Dbait遞釋系統(tǒng)及研究其對(duì)血腦屏障的通透性，為腦部腫瘤的治療提供理論基礎(chǔ)。
　　方法：1.熒光PEG-PAMAM-Tf/Dbait的構(gòu)建與鑒定：(1)采用三種物質(zhì)(熒光RBITC、NHS-PEG-MAL、Tf)逐步共價(jià)修飾PAMAM，合成能靶向血腦屏障的熒光PEG-PAMAM-Tf復(fù)合物，通過(guò)正負(fù)電荷相互吸引作用，放射增敏劑Dbait的負(fù)電荷與PAMAM表面的氨基N

2、H2通過(guò)靜電相吸，PAMAM將Dbait壓縮進(jìn)入空腔內(nèi)部，構(gòu)建熒光PEG-PAMAM-Tf/Dbait。(2)鑒定：通過(guò)氫核磁和SDS-PAGE鑒定熒光PEG-PAMAM-Tf納米載體，通過(guò)2.5％瓊脂糖凝膠電泳鑒定PEG-PAMAM-Tf/Dbait遞釋系統(tǒng)穩(wěn)定性。通過(guò)Dnase I酶和強(qiáng)陰離子SDS證明此遞釋系統(tǒng)包封完整、穩(wěn)定。2.CCK8檢測(cè)：PAMAM載體和經(jīng)過(guò)PEG修飾的PAMAM載體作用于U87細(xì)胞24h后細(xì)胞的吸光度。3.

3、體外血腦屏障的建立：bEnd.3細(xì)胞培養(yǎng)5-7天，顯微鏡下觀察其完全匯合，試漏實(shí)驗(yàn)及辣根過(guò)氧化物酶通透實(shí)驗(yàn)證明構(gòu)建成功。4.熒光顯微鏡觀察：通過(guò)轉(zhuǎn)染小鼠腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞Bend.3細(xì)胞，觀察熒光PEG-PAMAM-Tf/Dbait、熒光PAMAM/Dbait、熒光PEG-PAMAM/Dbait、三種納米粒體外表達(dá)效率的不同，觀察Tf對(duì)血腦屏障通透性的影響。
　　結(jié)果：1.通過(guò)1HNMR和SDS-PAGE表征：1HNMR圖譜中，2

4、.2-3.4 ppm處為PAMAM的骨架峰，3.6 ppm處為PEG中亞甲基的吸收峰，表明PEG-PAMAM合成成功，從SDS-PAGE結(jié)果可以看出，合成后的PEG-PAMAM-Tf條帶的分子量是115 KD左右，說(shuō)明PAMAM-PEG和轉(zhuǎn)鐵蛋白連接成功。2.5%瓊脂糖凝膠電泳證明PEG-PAMAM-Tf包封Dbait成功。Dnase I酶和強(qiáng)陰離子SDS證明納米粒包封完整、穩(wěn)定。2.CCK8檢測(cè)細(xì)胞增殖及毒性實(shí)驗(yàn)可以看出：隨著PAMA

5、M濃度的增加，細(xì)胞的OD值降低，而用PEG修飾PAMAM后與同等濃度下單純PAMAM組比較，OD值較高(P<0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。3.通過(guò)4h試漏試驗(yàn)液面差仍大于0.5 cm。辣根過(guò)氧化物酶透過(guò)率實(shí)驗(yàn)，對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組透過(guò)率比較(P<0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。4.熒光PEG-PAMAM-Tf/Dbait載體高分子的體外性質(zhì)考察，在PEG-PAMAM-Tf濃度為0.84 uM時(shí)，熒光顯微鏡檢測(cè)熒光強(qiáng)度最強(qiáng)。
　　結(jié)論：1.