去甲二氫愈創(chuàng)木酸體外抗骨肉瘤作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、骨肉瘤是惡性骨腫瘤中最常見的一種，發(fā)病年齡多在10-25歲，嚴(yán)重威脅兒童和青少年的健康。骨肉瘤對(duì)放射治療不敏感，主要采取手術(shù)聯(lián)合化療的手段進(jìn)行治療，骨肉瘤的化療療效得到肯定始于20世紀(jì)70年代，1982年提出新輔助化療的概念，使骨肉瘤的保肢手術(shù)取代了常規(guī)截肢術(shù)。目前臨床治療骨肉瘤的化療藥物仍以阿霉素、順鉑和大劑量的甲氨蝶羚為主，其他還有近年來應(yīng)用的異環(huán)磷酰胺等。雖然化療在骨肉瘤的治療中具有舉足輕重的作用，但骨肉瘤化療的總體有效率仍徘徊在

2、70％左右。制約其療效的主要因素有兩方面，一是高劑量強(qiáng)度所導(dǎo)致的嚴(yán)重的毒副作用，由于化療藥物個(gè)體差異較大，有效劑量與中毒劑量十分接近，因此相同劑量對(duì)于不同個(gè)體可能發(fā)生嚴(yán)重的粒細(xì)胞和（或）血小板下降。二是腫瘤細(xì)胞原發(fā)或繼發(fā)耐藥問題，也是化療失敗的主要原因。因此有人因骨肉瘤的原發(fā)耐藥問題質(zhì)疑新輔助化療。有研究指出，多藥耐藥是骨肉瘤化療失敗的主要原因。多藥耐藥基因產(chǎn)物P糖蛋白的表達(dá)與化療失敗有顯著的相關(guān)性，P糖蛋白高表達(dá)是多藥耐藥的主要機(jī)制，

3、P糖蛋白可通過它的疏水位點(diǎn)與疏水性抗腫瘤藥物結(jié)合，由ATP供能，逆濃度梯度將藥物泵出細(xì)胞外，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)藥物濃度降低而產(chǎn)生耐藥。研究表明，P糖蛋白的高表達(dá)合并腫瘤體積較大和發(fā)病年齡偏低，提示腫瘤復(fù)發(fā)率高。目前使用的腫瘤化療藥物存在副作用大和腫瘤細(xì)胞易產(chǎn)生耐藥性等缺陷，因而從天然化合物中尋找低毒、高效的抗癌藥物對(duì)于成骨肉瘤的治療有重要意義。因而開發(fā)新的高效低毒的抗骨肉瘤藥物或新的化療增效藥，是目前骨肉瘤治療中的重要課題。
　　 去甲

4、二氫愈創(chuàng)木二酸(Nordihydroguaiareticacid，NDGA)是木質(zhì)素類雌激素活性物質(zhì)，其生物學(xué)雌激素效應(yīng)相當(dāng)于17β—雌二醇效力的1/104了，約占茶葉干重的7％-8％，以常青灌木Larreadivaricata中含量最為豐富。去甲二氫愈創(chuàng)木酸具有抗炎，增強(qiáng)機(jī)體免疫力等多種生物學(xué)效應(yīng)，被廣泛的用作醫(yī)藥和化妝品原料。NDGA來源于天然物質(zhì)，近年被證實(shí)具有抗腫瘤作用，裸鼠實(shí)驗(yàn)證明其在有效劑量范圍內(nèi)毒性反應(yīng)小，開發(fā)NDGA作為

5、抗腫瘤藥品具有重要的現(xiàn)實(shí)意義和廣闊的應(yīng)用前景。通過裸鼠藥物毒性評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組指標(biāo)發(fā)現(xiàn)用藥后體重均有增加，其增長(zhǎng)幅度與對(duì)照組相似，無明顯差異，裸鼠的外觀、色澤、大便、活動(dòng)等均正常，未見明顯的毒副作用，無毒性效應(yīng)。NDGA能阻止乳腺癌、肝癌、肺癌、大腸癌及膠質(zhì)瘤等多種腫瘤的發(fā)生和抑制其細(xì)胞的增殖，但是對(duì)骨肉瘤作用的研究還未見報(bào)道。
　　 腫瘤發(fā)生是遺傳因素、環(huán)境因素共同作用導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路失調(diào)的過程。在腫瘤發(fā)生早期，環(huán)境中致癌物

6、或非致癌物等引起細(xì)胞代謝反應(yīng)失調(diào)，隨后信號(hào)通路失調(diào)，最終引起遺傳變異和自由生長(zhǎng)，導(dǎo)致腫瘤發(fā)生。哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(Themammaliantargetofrapamycin，mTOR)是一種高度保守的的絲/蘇氨酸蛋白激酶，屬于磷酸肌醇3激酶相關(guān)激酶家族。mTOR信號(hào)通路整合來自細(xì)胞內(nèi)外的各種信號(hào)，調(diào)節(jié)細(xì)胞的代謝、生長(zhǎng)增殖及存活等生理活動(dòng)。mTOR在細(xì)胞內(nèi)通過與其它分子形成復(fù)合物而保持生物學(xué)活性，目前認(rèn)為主要有兩種復(fù)合物:(1)mTO

7、RC1，由mTOR、Raptor、mLST8/GL和PRAS40組成。mTORC1能夠被雷帕霉素(rapamycin，Rap)抑制，接受生長(zhǎng)因子、營(yíng)養(yǎng)及能量、氧應(yīng)激等刺激，通過磷酸化下游底物4E-BP1和p70-S6K來調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)翻譯與合成。(2)mTORC2，由mTOR、mLST8/GL、rictor、mSin1、PRR5/Protor組成。mTORC2對(duì)雷帕霉素不敏感，通過磷酸化下游底物Akt來調(diào)節(jié)生長(zhǎng)因子信號(hào)通路。由于遺傳變異或者

8、環(huán)境因素等原因，導(dǎo)致PI3-k/Akt通路失調(diào)，mTOR信號(hào)通路在腫瘤發(fā)生過程中過度活化，促進(jìn)了細(xì)胞增殖、生長(zhǎng)、分化和存活。目前mTOR信號(hào)通路在骨肉瘤發(fā)病過程中的作用尚缺乏足夠的研究，能否針對(duì)mTOR信號(hào)通路開發(fā)新的抗骨肉瘤新藥還待于研究。研究目的:1.探討NDGA是否具有抗骨肉瘤作用;2.探討NDGA抗骨肉瘤作用的mTOR機(jī)制。
　　 研究方法:采用U20s、MG63、Saos三種骨肉瘤細(xì)胞系，用MMT、克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)藥物

9、對(duì)腫瘤生長(zhǎng)抑制的作用;CCK-8法、細(xì)胞劃痕試驗(yàn)和transwell小室模型分別測(cè)定藥物對(duì)腫瘤黏附力、遷移力和侵襲力影響，用流式細(xì)胞技術(shù)進(jìn)行細(xì)胞周期分析、凋亡率的測(cè)定，用熒光染色評(píng)估腫瘤凋亡的形態(tài)學(xué)改變;用Westernblot法檢測(cè)藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞mTOR通路蛋白、凋亡標(biāo)志蛋白caspase3、細(xì)胞周期素蛋白cyclinD1等的影響。
　　 結(jié)果:
　　 1.NDGA對(duì)骨肉瘤細(xì)胞具有抑制增殖的作用MTT檢測(cè)結(jié)果顯示，10

10、μmol/LNDGA對(duì)骨肉瘤的增殖沒有抑制作用，但從20μmol/L開始NDGA對(duì)骨肉瘤細(xì)胞具有明顯的生長(zhǎng)抑制作用，且呈時(shí)間和劑量依賴性。相同作用時(shí)間條件下，20、50、100μmol/LNDGA作用組間的比較表明，NDGA對(duì)骨肉瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用隨濃度的增加而增強(qiáng);相同作用濃度條件下，24、48和72h各組間相比表明，NDGA對(duì)骨肉瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用隨處理時(shí)間的延長(zhǎng)而增強(qiáng)。
　　 2.NDGA抑制骨肉瘤細(xì)胞克隆形成

11、　　 與對(duì)照組比較，不同濃度(10μmol/L、20μmol/L、50μmol/L)的NDGA對(duì)骨肉瘤細(xì)胞克隆形成均有抑制作用，細(xì)胞克隆形成率隨NDGA濃度升高而下降，NDGA濃度高于20μmol/L時(shí)細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，每個(gè)克隆包含的細(xì)胞數(shù)目少，且隨生長(zhǎng)時(shí)間增加未再出現(xiàn)新增殖細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)存活細(xì)胞數(shù)量少、活力低下，幾乎處于靜止期;對(duì)照組及不同濃度處理組克隆形成率分別為25.5％、17.5％、7.5％、0.75％;各組克隆形成率均有顯著差

12、異，P＜0.05。
　　 3.NDGA抑制骨肉瘤細(xì)胞黏附
　　 NDGA可以顯著抑制骨肉瘤細(xì)胞在纖連蛋白(Fn)的黏附。(10、20、50、100、150μmol/l)的NDGA作用24h后，黏附率分別為98.8±1.9％，86.9±2.0％，65.7±0.7％，32.8±0.8％和5.6±0.5％，20μmol/l以上的NDGA處理組與對(duì)照組比較有顯著性差異(P＜0.05)。
　　 4.NDGA抑制骨肉瘤細(xì)胞遷

13、移
　　 劃痕實(shí)驗(yàn)顯示:10、20、50、100μmol/l的NDGA作用48h后，可見NDGA能明顯抑制骨肉瘤細(xì)胞的遷移，呈劑量依賴性;隨著NDGA的濃度增大，骨肉瘤細(xì)胞向劃痕區(qū)移動(dòng)的距離越來越小，隨著藥物濃度增加遷移至劃痕區(qū)的細(xì)胞逐漸減少，劃痕增寬，高劑量組僅有少許細(xì)胞遷移至劃痕區(qū);20μmol/l的NDGA可以使骨肉瘤細(xì)胞遷移能力基本喪失，但NDGA濃度高于50μmol/l時(shí)細(xì)胞大量死亡。
　　 5.NDGA抑制骨

14、肉瘤細(xì)胞侵襲
　　 不同濃度NDGA處理的處理48h后，骨肉瘤骨肉瘤細(xì)胞侵襲穿透Matrigel膠和Transwell小室微孔膜的能力明顯下降，實(shí)驗(yàn)組穿膜細(xì)胞數(shù)目隨著藥物濃度增加明顯減少，對(duì)照組、30、50、100μmol/l組的穿膜細(xì)胞數(shù)目分別是(234.3±9.2)，（82.0±3.0），(39.0±3.0)，（12.3±1.5），各處理組與對(duì)照組比較有顯著性差異(P＜0.05)。說明NDGA以劑量依賴的方式抑制骨肉瘤細(xì)胞的

15、浸潤(rùn)侵襲能力。
　　 6.NDGA誘導(dǎo)骨肉瘤細(xì)胞周期阻滯
　　 不同濃度NDGA(20、50和100μmol/L)作用骨肉瘤細(xì)胞24h后，細(xì)胞周期發(fā)生明顯改變。流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果表明，NDGA作用后，Mg63、U2os骨肉瘤細(xì)胞周期被阻滯于G0/G1期，且該效應(yīng)在50μmol/L后趨于明顯，在100μmol/L濃度時(shí)效應(yīng)最大，處于S期細(xì)胞所占比例的明顯下降，但在Saos-2細(xì)胞，NDGA使骨肉瘤細(xì)胞周期被阻滯于S期。

16、r>　　 7.NDGA誘導(dǎo)骨肉瘤細(xì)胞凋亡
　　 不同濃度NDGA(100、150和200μmol/L)作用骨肉瘤細(xì)胞24h后，骨肉瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡改變。流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果表明，100μmol/LNDGA作用后，骨肉瘤細(xì)胞主要出現(xiàn)早期凋亡，但150μmol/L以上的NDGA引起骨肉瘤細(xì)胞晚期凋亡。
　　 8.NDGA下調(diào)mTOR信號(hào)通路蛋白的活性
　　 NDGA作用骨肉瘤細(xì)胞24h后，Westernblotting

17、檢測(cè)可見，NDGA濃度高于50μmol/L時(shí)mTOR信號(hào)通路下游底物磷酸化4E-BP1和S6水平與對(duì)照組相比明顯下調(diào)，但在低濃度（20μmol/L以下）時(shí)mTOR信號(hào)通路蛋白沒有明顯降低，甚至輕微上調(diào)。而NDGA高于100μmol/L時(shí)可以抑制Akt的磷酸化，NDGA不但抑制mTORC1信號(hào)通路蛋白的表達(dá)，而且抑制mTORC2信號(hào)通路蛋白活化。
　　 結(jié)論:本研究發(fā)現(xiàn)了NDGA抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖、克隆形成、黏附、遷移、侵襲，并誘