二氯化鈷誘導(dǎo)大鼠肝癌細(xì)胞系CBRH7919缺氧與凋亡和增殖的研究.pdf

1、目的：乏氧現(xiàn)象普遍存在于動(dòng)物和人的實(shí)體腫瘤中。低氧誘導(dǎo)因子(HIF)在乏氧狀態(tài)下被激活，作為重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，可以轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)下游許多基因，涉及腫瘤的血管生成、生長與轉(zhuǎn)移等，使腫瘤細(xì)胞適應(yīng)乏氧環(huán)境或者發(fā)生凋亡壞死。本實(shí)驗(yàn)為進(jìn)一步了解腫瘤細(xì)胞在乏氧狀態(tài)下的凋亡和增殖關(guān)系，以及探討HIF-1α在此誘導(dǎo)過程中的作用。 方法：利用二氯化鈷(CoCl<,2>)作為乏氧誘導(dǎo)劑。CBRH7919細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)后，COCl<,2>以100μM、20

2、0μM、300μM、400μM濃度分別作用24、48、72和96小時(shí)，利用MTT法檢測對(duì)肝癌細(xì)胞增殖的影響。CBRH7919細(xì)胞經(jīng)COCl<,2> 300μM分別處理0、4和24小時(shí)后利用RT-PCR法和免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測HIF-1 α在轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平的表達(dá)，利用流式細(xì)胞儀檢測肝癌細(xì)胞在不同缺氧程度下細(xì)胞周期的改變、線粒體膜電位的變化和細(xì)胞凋亡率的改變。 結(jié)果： 1、MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明CoCl<,2>在200μM，處

3、理24小時(shí)即產(chǎn)生明顯抑制作用。隨著藥物濃度的增加和處理時(shí)間的延長，抑制作用明顯增強(qiáng)。 2、RT-PCR的結(jié)果顯示對(duì)照組細(xì)胞HIF-1α mRNA不表達(dá)或極低表達(dá)，4小時(shí)處理組細(xì)胞HIF-1α mRNA低表達(dá)，而24小時(shí)處理組HIF-1α mRNA表達(dá)明顯增加。 3、免疫細(xì)胞化學(xué)法顯示對(duì)照組和4小時(shí)處理組HIF-1α不表達(dá)或極低表達(dá)，24小時(shí)處理組表達(dá)呈陽性或強(qiáng)陽性。4、流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示COCl<,2>在300μM，0、

4、 4、24小時(shí)處理后肝癌細(xì)胞凋亡率分別為2.31±1.1％、5.62±2.4％、21.2±7.5％。24小時(shí)處理組明顯高于對(duì)照組和4小時(shí)處理組。對(duì)照組和4小時(shí)處理組細(xì)胞周期改變不顯著，而24小時(shí)處理組出現(xiàn)顯著的G<,0>/G<,1>期阻滯。處理組CBRH7919細(xì)胞線粒體膜電位較對(duì)照組有不同程度的降低。 結(jié)論：利用COCl<,2>可以誘導(dǎo)大鼠肝癌細(xì)胞系CBRH7919發(fā)生凋亡。在輕微缺氧時(shí)，細(xì)胞凋亡不明顯，隨著缺氧程度的