重組E2蛋白在豬瘟的檢測(cè)及免疫方面的應(yīng)用研究.pdf

1、接種疫苗并檢測(cè)CSFV免疫抗體水平是預(yù)防與控制豬瘟的重要技術(shù)手段。本研究通過(guò)原核表達(dá)系統(tǒng)高效表達(dá)了可溶性的CSFVE2蛋白，用親和層析方法純化，獲得重組E2蛋白抗原。進(jìn)行了豬瘟的檢測(cè)及免疫方面的應(yīng)用研究：建立了一種檢測(cè)CSFV抗體的間接ELISA方法，研制了相應(yīng)的診斷試劑盒；將純化的重組E2蛋白制作為亞單位分子疫苗，通過(guò)免疫本動(dòng)物豬，研究了免疫效果。以上研究為最終成功研制安全、高效、可鑒別的豬瘟亞單位疫苗奠定了基礎(chǔ)。 1.在大腸

2、桿菌中表達(dá)可溶性的CSFVE2蛋白。 應(yīng)用RT-PCR和nPCR擴(kuò)增了中國(guó)CSF兔化弱毒(C-株)的E2基因，構(gòu)建了原核表達(dá)載體pGEX4T-1，轉(zhuǎn)入到宿主菌BL21(Star)中，在較低的溫度(16℃)和硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)濃度(0.1mmol/L)下對(duì)重組菌進(jìn)行了誘導(dǎo)表達(dá)，高效表達(dá)了可溶性的重組E2蛋白。結(jié)果顯示，E2蛋白在大腸桿菌中得到了高效表達(dá)，可溶性蛋白的表達(dá)量占融合蛋白的40％。 2.用親和層析

3、法純化重組E2蛋白。 GST融合蛋白與谷胱甘肽的結(jié)合是可逆的，用加入還原性谷胱甘肽的洗脫液可以高效地把結(jié)合態(tài)GST融合蛋白洗脫下來(lái)。本實(shí)驗(yàn)使用MagneGST吸附型樹(shù)脂顆粒，通過(guò)親和層析方法快速、簡(jiǎn)易、高效地從表達(dá)菌中分離純化出重組E2蛋白，親和層析純化后其純度可達(dá)到約85％，其濃度可達(dá)5mg/mL，為研究豬瘟診斷試劑盒和新型亞單位分子疫苗奠定了堅(jiān)實(shí)的物質(zhì)基礎(chǔ)。 3.建立并優(yōu)化了一種檢測(cè)CSFV抗體的間接ELISA方法，

4、并研制出相應(yīng)的豬瘟間接ELISA診斷試劑盒。用純化的重組E2蛋白作為抗原包被酶標(biāo)板，以辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的兔抗豬IgG為二抗，建立了檢測(cè)豬瘟病毒抗體的間接ELISA方法，并確定了ELISA最佳工作條件：抗原包被濃度分別為8.91μg/mL；包被條件為37℃放置1h后，再4℃過(guò)夜；豬瘟陽(yáng)性血清(1∶80)在37℃作用45min，酶標(biāo)二抗(1∶1000)在37℃作用45min；底物溶液37℃顯色15min。通過(guò)敏感性實(shí)驗(yàn)、特異性試

5、驗(yàn)、重復(fù)性試驗(yàn)、對(duì)比實(shí)驗(yàn)和穩(wěn)定性試驗(yàn)，表明：該方法的特異性為98.6％，敏感性為95.3％；與國(guó)外IDEXX公司的同類(lèi)試劑盒比較，兩者的符合率為92％。用已建立的方法檢測(cè)送檢血清樣本500份，陽(yáng)性率為86.4％。 4.用重組E2蛋白進(jìn)行本動(dòng)物免疫實(shí)驗(yàn)。 利用大腸桿菌表達(dá)的可溶性重組E2蛋白作為抗原，用弗式佐劑乳化后經(jīng)皮下途徑接種40日齡仔豬(豬瘟病毒抗原抗體皆為陰性)7頭。每次免疫后21天后采血，利用夾心ELISA和正向

6、間接血凝檢測(cè)抗體的變化，第二次免疫后21天時(shí)進(jìn)行攻毒保護(hù)試驗(yàn)。結(jié)果表明，第二次加強(qiáng)免疫后抗體水平明顯上升；攻毒后對(duì)照組4頭豬中有三頭在3～8天之間全部死亡，第四頭豬在14天時(shí)處于頻死狀態(tài)，疫苗免疫豬全部存活，無(wú)豬瘟病毒感染后的臨床癥狀；無(wú)菌采免疫組豬的扁桃體和脾臟，利用RT-PCR方法擴(kuò)增E2基因，結(jié)果為陰性，利用IDEXX公司CSFV抗原檢測(cè)試劑盒檢測(cè)豬瘟病毒抗原為陰性。本動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果證明利用大腸桿菌表達(dá)的重組E2蛋白能夠誘導(dǎo)豬產(chǎn)生中