C-28F TM-TNF-α突變體的正向信號和反向信號效應(yīng).pdf

1、腫瘤壞死因子-α(tumornecrosisfactor-α，TNF-α)具有多種生物學(xué)功能，在體內(nèi)以跨膜型(TransmembraneTNF-α，TM-TNF-α)和分泌型(secretedTNF-α，S-TNF-α)兩種形式發(fā)揮作用。TM-TNF-α是S-TNF-α的前體。在一級結(jié)構(gòu)上，TM-TNF-α比S-TNF-α多一個由76個氨基酸組成的信號肽。本室前期研究工作表明，TM-TNF-α比S-TNF-α具有更廣的殺瘤譜，可殺傷S-

2、TNF-α耐受的腫瘤細(xì)胞；TM-TNF-α主要引起靶細(xì)胞凋亡，S-TNF-α則主要引起靶細(xì)胞壞死。 TM-TNF-α不但可以作為配體，與受體結(jié)合傳遞正向信號，而且還可作為受體向效應(yīng)細(xì)胞傳遞反向信號。已發(fā)現(xiàn)反向信號對效應(yīng)細(xì)胞本身的功能具有調(diào)節(jié)作用。由于表達(dá)TM-TNF-α的細(xì)胞同時表達(dá)TNFR，因此，在研究反向信號中難以消除正向信號的干擾。在我們前期研究TM-TNF-α結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系時，發(fā)現(xiàn)在-28位將半胱氨酸置換成苯丙氨酸，使T

3、M-TNF-α的殺傷作用完全消失，但仍然保留與TNFR的結(jié)合能力。據(jù)此推測該突變體可能失去了正向信號，但卻仍然保留反向信號。為此，本研究的主要目的是驗證該突變體是否僅能傳遞反向信號，為研究TM-TNF-α反向信號提供有力的實驗工具。該研究主要結(jié)果如下： 一、C-28FTM-TNF-α突變體喪失正向信號 1.C-28F位突變體喪失誘導(dǎo)單核細(xì)胞系U937細(xì)胞產(chǎn)生NO的能力：結(jié)果顯示未經(jīng)刺激的U937細(xì)胞分泌基礎(chǔ)量的NO，轉(zhuǎn)染

4、野生型TM-TNF-α的COS-7可明顯誘導(dǎo)U937細(xì)胞產(chǎn)生NO，而轉(zhuǎn)染C-28F突變體的COS-7細(xì)胞卻失去TM-TNF-α誘導(dǎo)U937細(xì)胞產(chǎn)生NO的能力。 2.C-28FTM-TNF-α突變體喪失誘導(dǎo)U937細(xì)胞產(chǎn)生iNOSmRNA的效應(yīng)：RT-PCR和realtimePCR證實正常U937細(xì)胞表達(dá)少量iNOSmRNA，轉(zhuǎn)染野生型TM-TNF-αCOS-7細(xì)胞能顯著提高U937細(xì)胞的iNOSmRNA轉(zhuǎn)錄，其表達(dá)提高了約90％

5、，而轉(zhuǎn)染C-28F突變體的細(xì)胞則無TM-TNF-α的這種效應(yīng)。 3.C-28FTM-TNF-α突變體喪失殺傷HL-60細(xì)胞的能力：AnnexinV和PI檢測證實轉(zhuǎn)染野生型TM-TNF-α的COS-7細(xì)胞具有明顯的殺傷效應(yīng)，其殺傷率為79％；但轉(zhuǎn)染C-28F突變體的細(xì)胞與其它對照一樣，對HL-60細(xì)胞不具有殺傷效應(yīng)。提示C-28F突變體失去了TM-TNF-α對耐受sTNF-α腫瘤細(xì)胞的殺傷效應(yīng)。 4.C-28FTM-TNF

6、-α喪失抑制Raji細(xì)胞I-κB降解的效應(yīng)：Westernblotting結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染野生型TM-TNF-α的COS-7細(xì)胞能夠有效地抑制Raji細(xì)胞胞漿內(nèi)I-κB的降解，而轉(zhuǎn)染C-28FTM-TNF-α突變體的細(xì)胞則無此效應(yīng)，因靶細(xì)胞胞漿內(nèi)I-κB含量與各種對照比較無明顯差異。 二、C-28FTM-TNF-α突變體保留野生型TM-TNF-α的反向信號 1.野生型和C-28F突變型TM-TNF-α反向信號促進S-TNF-

7、α誘導(dǎo)IL-8mRNA的轉(zhuǎn)錄：RT-RealtimePCR證實S-TNF-α可刺激U937細(xì)胞IL-8mRNA轉(zhuǎn)錄，用sTNFR1激活內(nèi)源性TM-TNF-α反向信號，可明顯促進S-TNF-α誘導(dǎo)的IL-8mRNA轉(zhuǎn)錄；轉(zhuǎn)染野生型和突變型C-28FTM-TNF-α可明顯增強該反向信號的效應(yīng)。提示C-28F突變體仍然保留TM-TNF-α傳遞反向信號的功能。 2.野生型和C-28F突變型TM-TNF-α反向信號促進I-κB降解：Wes