中藥五谷蟲對感染創(chuàng)面抗菌作用的臨床與分子機(jī)制研究.pdf

1、慢性難治性感染創(chuàng)面臨床常見，如脊髓損傷截癱患者壓瘡潰爛和感染，慢性化膿性骨髓炎的感染創(chuàng)面，下肢靜脈性潰瘍和糖尿病晚期下肢潰瘍創(chuàng)面等。這些感染創(chuàng)面的特點(diǎn)是：病程長，潰瘍創(chuàng)面經(jīng)久不愈；多為混合感染，常規(guī)治療方法療效差；創(chuàng)面的壞死組織界限不清，外科清創(chuàng)術(shù)治療困難，嚴(yán)重影響患者健康和生活質(zhì)量。特別是由于抗生素的濫用，細(xì)菌對抗生素的耐藥情況日益嚴(yán)重，從而降低了抗生素對創(chuàng)面感染的抗菌功效，使這類創(chuàng)面治療更加困難。因此，如何有效地治療慢性難治性感染創(chuàng)

2、面是外科領(lǐng)域一直沒有解決的難題之一。 傳統(tǒng)中藥材“五谷蟲”，又名蛆蟲，為麗蠅科絲光綠蠅、大頭金蠅的幼蟲?！侗静萸笤础?、《本草便讀》均記載：該蟲性寒無毒，可搽敷外用，能治療臁瘡等感染性外科疾病。為臨床治療慢性難治性感染創(chuàng)面提供了一種新的思路。但是中醫(yī)學(xué)對五谷蟲治療感染創(chuàng)面缺乏系統(tǒng)的研究，其抗菌機(jī)制還不十分清楚。近年來，Sherman R．A．等國外學(xué)者發(fā)現(xiàn)，五谷蟲治療感染創(chuàng)面，能有效地促進(jìn)創(chuàng)面愈合，抵抗細(xì)菌感染。但目前研究仍主要集

3、中于臨床治療病例報(bào)道，缺乏與五谷蟲抗菌作用相關(guān)的臨床與分子生物學(xué)的系統(tǒng)研究。 本課題采用中西醫(yī)結(jié)合的方法，對五谷蟲對感染創(chuàng)面抗菌作用的臨床與分子機(jī)制進(jìn)行系統(tǒng)地研究。旨在(1)探索系統(tǒng)的五谷蟲培育和消毒技術(shù)，為臨床和基礎(chǔ)研究提供材料來源：(2)分析五谷蟲的抗菌物質(zhì)，觀察其抗菌活性，確定其對感染創(chuàng)面起到生物學(xué)作用的有效成份，為進(jìn)一步對其進(jìn)行藥效、藥理學(xué)和“基因工程”制劑生產(chǎn)研究奠定理論基礎(chǔ)；(3)探討五谷蟲對感染創(chuàng)面抗菌與促進(jìn)愈合作

4、用的機(jī)理，為五谷蟲臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。 本課題研究分三部分：(1)醫(yī)用五谷蟲制備及其粗提物的抗菌活性研究：(2)五谷蟲抗菌物質(zhì)的純化鑒定及其分子結(jié)構(gòu)的實(shí)驗(yàn)研究；(3)五谷蟲對創(chuàng)面的抗菌與促進(jìn)愈合作用研究。 第一部分醫(yī)用五谷蟲制備及其粗提物的抗菌活性研究1．醫(yī)用五谷蟲的制備技術(shù)研究本研究在室內(nèi)常溫環(huán)境下，采用無菌飼料對五谷蟲主要蟲種“絲光綠.蠅幼蟲”進(jìn)行人工飼養(yǎng)、繁殖傳代，對蟲卵、蟲體進(jìn)行“雙重消毒”處理。研究發(fā)現(xiàn)：絲光

5、綠蠅的幼蟲能在室內(nèi)環(huán)境下人工飼養(yǎng)、穩(wěn)定傳代，可以作為五谷蟲臨床與基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)的材料來源。蟲卵、蟲體“雙重消毒”的方法能有效地對五谷蟲進(jìn)行消毒處理，減少五谷蟲在飼養(yǎng)和使用過程中受到醫(yī)源性感染的機(jī)會。 2．五谷蟲粗提物對標(biāo)準(zhǔn)菌株的抗菌活性研究本研究采用離心分離方法獲得五谷蟲分泌物和蟲體組織勻漿粗提物。分別以金黃色葡萄球菌、大腸埃希氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株作為指示菌，對五谷蟲粗提物進(jìn)行瓊脂平板法抗菌試驗(yàn)，用SDS-PAGE對粗提物進(jìn)行電泳分析。結(jié)果顯

6、示：五谷蟲粗提物組的抑菌環(huán)直徑明顯大于對照組，統(tǒng)計(jì)學(xué)有顯著性差異(P<0.01)。研究發(fā)現(xiàn)：五谷蟲分泌物和蟲體組織勻漿粗提物中均含有同樣有效的抗菌物質(zhì)，對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌均有抗菌作用。該抗菌物質(zhì)以分子量較小的有機(jī)成分為主。 3．五谷蟲對感染創(chuàng)面致病細(xì)菌的抗菌作用研究本研究以糖尿病足潰瘍創(chuàng)面上分離培養(yǎng)的金黃色葡萄球菌為指示菌，提取五谷蟲粗提物，對粗提物采用平板法做抗菌實(shí)驗(yàn)，頭孢哌酮和生理鹽水做對照。結(jié)果顯示：實(shí)驗(yàn)組的抑菌環(huán)

7、直徑明顯大于對照組，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析有顯著性差異(P<0.01)。研究發(fā)現(xiàn)：五谷蟲對金黃色葡萄球菌(一般致病菌)具有抗菌作用。 以糖尿病足潰瘍創(chuàng)面上分離培養(yǎng)的銅綠假單胞菌(綠膿桿菌)為指示菌，提取五谷蟲粗提物，對粗提物采用平板法做抗菌實(shí)驗(yàn)，頭孢哌酮和生理鹽水做對照。結(jié)果顯示：實(shí)驗(yàn)組的抑菌環(huán)直徑明顯大于對照組，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析有顯著性差異(P<0.01)。研究發(fā)現(xiàn)：五谷蟲對綠膿桿菌(特殊致病菌)具有抗菌作用。 本實(shí)驗(yàn)以脊髓損傷后截癱患

8、者壓瘡感染創(chuàng)面上分離培養(yǎng)的金黃色葡萄球菌為指示菌，提取經(jīng)過指示菌針刺感染誘導(dǎo)后的五谷蟲粗提物作為實(shí)驗(yàn)組，采用平板法做抗菌實(shí)驗(yàn)，未經(jīng)感染誘導(dǎo)的五谷蟲粗提物和頭孢哌酮做對照。結(jié)果顯示：實(shí)驗(yàn)組的抑菌環(huán)直徑明顯大于對照組，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析有顯著性差異(P<0.01)。研究說明：通過針刺感染誘導(dǎo)的外源性刺激能增強(qiáng)五谷蟲抗菌物質(zhì)的抗菌能力。 第二部分五谷蟲抗菌物質(zhì)的活性鑒定、分離純化及其分子結(jié)構(gòu)的實(shí)驗(yàn)研究1．濁度法檢測五谷蟲分泌物抗菌活性的實(shí)驗(yàn)研

9、究本研究以金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株為指示菌，將五谷蟲分泌物粗提物與指示菌共同培養(yǎng)。用酶標(biāo)儀測量培養(yǎng)液的光密度值，繪制光密度一時(shí)間曲線。用考馬斯亮藍(lán)法檢測并調(diào)整分泌物中的蛋白質(zhì)含量，采用濁度法檢測不同蛋白質(zhì)濃度分泌物樣品的抗菌活性。結(jié)果顯示：五谷蟲粗提物與金黃色葡萄球菌共同培養(yǎng)21小時(shí)，金黃色葡萄球菌的吸收光密度OD值隨著時(shí)間的增加而降低，對照液中金黃色葡萄球菌的吸光密度OD值隨著時(shí)間的增加而增加，與對照液相比較，五谷蟲粗提物對于金黃色葡萄

10、球菌的生長產(chǎn)生了明顯的抑制作用。抗菌活性隨著分泌物中蛋白含量的變化而出現(xiàn)變化，0.8mg/ml、0.4mg/ml蛋白含量的分泌物抑菌效果明顯，0.2mg/ml、0.1mg/ml蛋白含量的分泌物樣品液無明顯抑菌效果。實(shí)驗(yàn)說明：蛋白質(zhì)濃度的調(diào)整會引起五谷蟲抗菌物質(zhì)抗菌活性的相應(yīng)變化。 2．五谷蟲分泌物抗菌活性物質(zhì)的鑒定分析本研究將五谷蟲分泌物樣品液經(jīng)過DEAE離子交換層析，收集洗脫液和淋洗液，將洗脫液和淋洗液分別與金黃色葡萄球菌液于

11、37℃溫箱共同培養(yǎng)21小時(shí)，濁度法檢測抗菌活性。SDS-PAGE技術(shù)對五谷蟲分泌物樣品液、洗脫液和淋洗液進(jìn)行電泳，行考馬斯亮蘭染色，完成抗菌物質(zhì)的鑒定分析。結(jié)果顯示：淋洗液的OD值隨著時(shí)間的增加而增加：洗脫液的OD值明顯低于淋洗液的OD值，洗脫液對于金黃色葡萄球菌的生長產(chǎn)生了明顯的抑制作用。五谷蟲分泌物樣品液、洗脫液經(jīng)過SDS-PAGE電泳可見相似的蛋白質(zhì)成分條帶，淋洗液未見明顯的蛋白質(zhì)條帶顯示。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：五谷蟲分泌物中的抗菌活性物質(zhì)是

12、蛋白質(zhì)類物質(zhì)，其等電點(diǎn)小于8；DEAE離子交換層析可以作為分泌物中抗菌物質(zhì)的分離提純方法。 3．五谷蟲抗菌活性物質(zhì)的純化研究本研究通過離子交換和凝膠過濾兩步層析對五谷蟲分泌物中的抗菌物質(zhì)進(jìn)行分離提純，在提純過程中用濁度法檢測洗脫液的抗菌活性，將洗脫液進(jìn)行編號收集，進(jìn)行SDS-PAGE與銀染，尋找并獲得分泌物中抗菌物質(zhì)的蛋白質(zhì)條帶。結(jié)果顯示：離子交換層析后，五谷蟲分泌物中的蛋白質(zhì)成分被完全洗脫下來，進(jìn)入到編號的收集管洗脫液中，第3

13、3管洗脫液的蛋白質(zhì)成分具有明顯的抗菌活性；對第33管洗脫液進(jìn)行凝膠過濾層析，層析后的洗脫液進(jìn)入到編號收集管中，第13、14、15管洗脫液具有抗菌活性，其他收集管的洗脫液無抗菌活性；第13、14、15管洗脫液均顯示出一條清晰的蛋白條帶而且分子量相同，分子量小于14.4KDa。實(shí)驗(yàn)證實(shí)：離子交換層析和凝膠過濾層析能夠?qū)ξ骞认x分泌物中的抗菌蛋白進(jìn)行有效地分離、純化。 4．五谷蟲抗菌活性物質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)及生物信息學(xué)研究本實(shí)驗(yàn)將經(jīng)過層析純化

14、和SDS-PAGE而獲得的五谷蟲分泌物的抗菌蛋白條帶切下，用胰蛋白酶水解。采用納升級電噴霧質(zhì)譜技術(shù)對酶解后抗菌蛋白產(chǎn)生的肽片段進(jìn)行分子結(jié)構(gòu)與生物信息學(xué)研究，尋找與該抗菌蛋白相關(guān)的同源性物質(zhì)，獲得該抗菌蛋白的生物學(xué)信息。結(jié)果顯示：抗菌蛋白中存在 ENAGEDPGLAR、LGKDAVEDLESVGK、DAvEDLESVGK共3個肽片段的氨基酸序列信息；經(jīng)Bioworks軟件檢索NCBInr數(shù)據(jù)庫，搜索同源性蛋白質(zhì)信息，共得到三種蛋白質(zhì)：de

15、rmcidinPreproprotein[Homo sapiens](人源汗腺抗菌肽前原蛋白)；dermcidinpreproprotein[Macaca mulatta](獼猴源汗腺抗菌肽前原蛋白)；proteinphosphatase 1 inhib．(蛋白磷酸酶1抑制蛋白)。研究發(fā)現(xiàn)：五谷蟲分泌物的抗菌蛋白是與Dermcidin preproprotein具有一定同源性的抗菌肽類物質(zhì)。 第三部分五谷蟲對創(chuàng)面的抗菌與促進(jìn)愈合

16、作用研究1．五谷蟲對DM大鼠潰瘍創(chuàng)面的抗菌與愈合作用本研究采用付小兵DM大鼠潰瘍創(chuàng)面動物模型，將五谷蟲分泌物外敷于實(shí)驗(yàn)組創(chuàng)面，通過組織形態(tài)學(xué)和免疫組化的方法研究五谷蟲分泌物對DM大鼠潰瘍組織中堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)和結(jié)締組織生長因子(CTGF)表達(dá)的影響。結(jié)果顯示：五谷蟲分泌物能提高DM大鼠潰瘍創(chuàng)面中bFGF和CTGF的表達(dá)，其表達(dá)水平明顯高于對照組，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析有顯著性差異(P<0.01)，實(shí)驗(yàn)說明五谷蟲分泌物具有促進(jìn)創(chuàng)面愈

17、合的作用。 取實(shí)驗(yàn)組和對照組潰瘍創(chuàng)面分泌物作細(xì)菌培養(yǎng)，記錄創(chuàng)面細(xì)菌感染情況。結(jié)果顯示：對照組金葡菌感染率為60％，實(shí)驗(yàn)組潰瘍創(chuàng)面一般菌培養(yǎng)結(jié)果為陰性，未見致病細(xì)菌生長。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：五谷蟲分泌物具有預(yù)防創(chuàng)面細(xì)菌感染的作用。 2．五谷蟲對感染創(chuàng)面抗菌與生物清創(chuàng)作用的臨床研究本研究對6例糖尿病足部潰瘍患者的感染創(chuàng)面、5例脊髓損傷后截癱患者的壓瘡創(chuàng)面運(yùn)用活體五谷蟲進(jìn)行治療，取創(chuàng)面分泌物作菌培養(yǎng)，記錄培養(yǎng)結(jié)果，觀察創(chuàng)面愈合情況。結(jié)果