異種造血嵌合體預(yù)防急性GVHD的作用機(jī)制.pdf

1、目的異種移植被認(rèn)為是有潛力的解決器官供源不足的方法，但異種移植面臨的免疫排斥比同種異體移植更復(fù)雜，移植物抗宿主病(GVHD)更為嚴(yán)重。我們應(yīng)用大鼠-小鼠造血嵌和體模型，進(jìn)一步研究反向骨髓移植對(duì)aGVHD的預(yù)防機(jī)制。 方法1、異種骨髓嵌合體模型的建立：術(shù)前5天SD大鼠(8～10周齡，雌性，SPF級(jí))開始飲含紅霉素(250mg/L)和慶大霉素(320mg/L)抗生素溶液凈化腸道。無(wú)菌條件下取BALB/C小鼠(8～10周齡，雌性，SP

2、F級(jí))的骨髓細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，SD大鼠接受7.5Gy(照射率0.5Gy/min)全身照射(TBI)后4小時(shí)內(nèi)經(jīng)尾靜脈輸入上述BALB/c小鼠骨髓細(xì)胞2×108/只，48小時(shí)后腹腔注射環(huán)磷酰胺50mg/kg(此預(yù)處理方案為非清髓性)，將該嵌合了BALB/c小鼠骨髓細(xì)胞的供體大鼠飼養(yǎng)30天后，檢測(cè)外周血嵌合率，并做皮片移植，結(jié)果證實(shí)小鼠源性骨髓已在大鼠體內(nèi)植活，并誘導(dǎo)出對(duì)BALB/c小鼠的特異性耐受。再將該嵌合體SD大鼠的骨髓細(xì)胞移植到

3、目標(biāo)受體(BALB/C小鼠)。 2、實(shí)驗(yàn)分組：A，B，C組以BALB/C(8～10周齡，雌性，SPF級(jí))小鼠為受鼠，D組以無(wú)關(guān)第3者B6小鼠為受鼠，腸道凈化后接受9Gy60Coγ射線致死性TBI：A組經(jīng)尾靜脈輸注正常SD大鼠的骨髓細(xì)胞4×107/只；B組經(jīng)尾靜脈輸注嵌合體SD大鼠的骨髓細(xì)胞4×107/只；C組經(jīng)尾靜脈輸注生理鹽水；D組經(jīng)尾靜脈輸注嵌合體SD大鼠的骨髓細(xì)胞4×107/只。觀察各組小鼠aGVHD的臨床表現(xiàn)及生存時(shí)間，

4、瀕死小鼠做病理分析。移植后15天測(cè)定TNF-α、INF-γ與IL-4的產(chǎn)量，移植后30天做混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)和皮片移植，并追蹤移植后小鼠嵌合率的變化。3、各組小鼠的GVHD評(píng)分及生存時(shí)間：評(píng)價(jià)GVHD包括5個(gè)參數(shù)：體重下降，弓背體態(tài)，活動(dòng)度，皮毛質(zhì)地，皮膚完整度。分析時(shí)每一項(xiàng)都有0-2個(gè)等級(jí)。評(píng)分為5項(xiàng)參數(shù)的分?jǐn)?shù)總和，最高為10分。評(píng)分＞5分屬于重度GVHD，3-5分屬于中度GVHD，每周評(píng)分一次。每隔一定時(shí)間檢驗(yàn)外周血WBC計(jì)數(shù)；并且比

5、較四組小鼠平均存活時(shí)間(MST)。 4、皮膚移植取SD大鼠及Whistar大鼠腹部全厚皮片，直徑約1cm，刮除皮下脂肪，分別移植于耐受誘導(dǎo)的BALB/C小鼠側(cè)背部移植床上，待干燥后用創(chuàng)可貼包扎傷口。于皮膚移植3天后剪開創(chuàng)可貼，開始每日觀察移植物的顏色、硬度，有無(wú)結(jié)痂、脫落及鼠毛生長(zhǎng)。如皮片變硬或結(jié)痂脫落，則判定為移植物排斥；皮片柔軟或鼠毛生長(zhǎng)則判定為存活或耐受。 5、細(xì)胞因子水平的測(cè)定移植后第5天用酶聯(lián)免疫吸附法(ELI

6、SA)測(cè)定A組與B組血清TNF-α，INF-γ與IL-4濃度。第14天取A組與B組的脾細(xì)胞，4×105個(gè)/孔鋪于96孔培養(yǎng)板中，加入用絲裂霉素滅活的異種抗原Whistar大鼠脾細(xì)胞2×105個(gè)/孔，于37℃、濕化的5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4小時(shí)后收集上清液，酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測(cè)TNF-α產(chǎn)量，48小時(shí)后收集上清液，測(cè)INF-γ與IL-4量。 6、嵌合體的測(cè)定取移植后小鼠外周血50μl，加入FITC標(biāo)記的抗大鼠MHC-CL

7、ASSⅠ單克隆抗體(1μg/106細(xì)胞)，避光，4℃下標(biāo)記30分鐘。用紅細(xì)胞裂解液去掉紅細(xì)胞，PBS洗滌細(xì)胞2次，上流式細(xì)胞儀(FACScan；BectonDickinson)檢測(cè)移植小鼠外周血中大鼠源性細(xì)胞嵌合情況。 7、單向混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)(MLR)：檢測(cè)A、B組小鼠對(duì)特異供體及無(wú)關(guān)供者的反應(yīng)性。分別取A、B組小鼠與正常BALB/C小鼠的脾細(xì)胞為反應(yīng)細(xì)胞，以正常SD大鼠與Whistar大鼠脾細(xì)胞為刺激細(xì)胞，做混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)

8、(MLR)，于96孔培養(yǎng)板每孔加反應(yīng)細(xì)胞100μl(4×105個(gè))和刺激細(xì)胞50μl(2×105個(gè))，設(shè)自體反應(yīng)孔，每組3復(fù)孔，于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)96小時(shí)，終止培養(yǎng)前18小時(shí)，每孔加入1μCi3H-TdR(中國(guó)原子能研究所)，自動(dòng)液閃計(jì)數(shù)器(Beckman，USA)測(cè)定，結(jié)果用cpm±SD表示。 結(jié)果：1、反向骨髓移植減輕GVHD：A組小鼠從移植后第4天開始出現(xiàn)弓背體位、體重下降、精神萎靡、活動(dòng)度差、腹瀉、毛臟亂、皮

9、膚潰瘍等典型GVHD表現(xiàn)，第5天開始死亡并持續(xù)下去，至第60天累計(jì)存活率為50％(4/8)，GVHD發(fā)生率為100％，其中50％為重度(評(píng)分＞5分)。B組小鼠除第8天死亡1只外均存活至60天，第60天累計(jì)存活率為87.5％(7/8)，GVHD發(fā)生率50％，均為輕～中度(評(píng)分＜5分)。C組10天內(nèi)均死于骨髓衰竭，證明此預(yù)處理方案是致死性的。與A組比較，B組GVHD的發(fā)生率及嚴(yán)重度降低，生存期明顯延長(zhǎng)，而D組與A組比較無(wú)顯著性差異(P＞0.

10、05)，證明反向移植減輕GVHD的影響是供者特異性的. 2、反向骨髓移植可降低TNF-α與IFN-γ，升高IL-4：BMT后14天，B組脾細(xì)胞在異基因抗原刺激后產(chǎn)生的IL-4較A組高，同時(shí)IFN-γ與TNF-α產(chǎn)量顯著下降(P＜0.001)。BMT后第5天(GVHD死亡高峰期)測(cè)血清細(xì)胞因子濃度：B組血清IFN-γ，TNF-α水平明顯低于A組，而IL-4升高，與上述體外培養(yǎng)的結(jié)果相符。 3、混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)(MLR)結(jié)果

11、：移植第30天，A組與B組小鼠脾細(xì)胞對(duì)供體SD大鼠脾細(xì)胞的單向混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)特異性降低(與正常BALB/c小鼠比較，P＜0.001)，但對(duì)無(wú)關(guān)第3者Whistar大鼠的脾細(xì)胞有強(qiáng)烈的增殖反應(yīng)，證明移植誘導(dǎo)的耐受是供者特異性的。其中，B組的增殖抑制程度更大，為(4641.97±174.97)cpm，同A組相比，二者有顯著性差異(P＜0.01)，提示反向移植可進(jìn)一步抑制受鼠脾細(xì)胞對(duì)供者抗原的增殖。 4、病理分析：A組、D組死亡小鼠

12、病理學(xué)改變符合GVHD病理變化。表現(xiàn)為：①皮膚：基底細(xì)胞空泡變性、溶解壞死，大量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)；②肝臟：，肝細(xì)胞呈不同程度的變性或壞死，匯管區(qū)有較廣泛淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，③小腸：腸粘膜水腫和出血，，部分糜爛，小腸絨毛壞死脫落。黏膜下層淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。病理改變屬于GVHDⅡ～Ⅲ級(jí)。B組小鼠病理改變明顯輕于A組D組，僅為輕度炎癥反應(yīng)，為GVHDⅠ級(jí)。 5、移植皮膚存活情況：BMT后30d進(jìn)行皮膚移植，B組移植小鼠對(duì)SD大鼠皮膚移植物的存活時(shí)間

13、明顯大于A組(P＜0.05)，但Wistar大鼠的皮膚移植物均在2周內(nèi)排斥，與對(duì)照組(系天然BALB/C小鼠)比較無(wú)顯著性差異(P＞005)，表明嵌和體模型誘導(dǎo)出的組織移植耐受是供者特異性的。 6、嵌合率測(cè)定：移植后90天受者體內(nèi)大鼠MHC-Ⅰ類分子陽(yáng)性細(xì)胞比例仍為23.77±4.50％，明顯高于對(duì)照組，且對(duì)供體大鼠的MLR長(zhǎng)期保持抑制狀態(tài)，供者皮膚移植物的存活時(shí)間明顯大于對(duì)照組，提示大鼠細(xì)胞能長(zhǎng)時(shí)間以較高比例嵌合在小鼠體內(nèi)，并

14、發(fā)揮正常功能.此外，我們研究了受者外周血WBC計(jì)數(shù)，B組造血恢復(fù)時(shí)間明顯縮短，從第9天起WBC計(jì)數(shù)始終比A組高，顯示反向BMT促進(jìn)受者造血的重建。 結(jié)論：1、反向骨髓移植可降低GVHD發(fā)病率與嚴(yán)重度，延長(zhǎng)移植小鼠的生存期，且影響是供者特異性的. 2、反向移植可通過(guò)減少Th1類細(xì)胞因子(如IFN-γ)產(chǎn)量，提高Th2類細(xì)胞因子(如IL-4)，極化供者T細(xì)胞向Th2方向極化，并進(jìn)一步抑制受鼠脾細(xì)胞對(duì)供者抗原的增殖，從而減輕急