亞硒酸鈉在結(jié)腸癌細(xì)胞中誘導(dǎo)氧化還原依賴的Bax激活與細(xì)胞凋亡的研究.pdf

1、很多證據(jù)表明硒化合物具有抑制腫瘤發(fā)生的化學(xué)預(yù)防作用，最近研究表明硒化合物可能具有成為化療藥物用于腫瘤治療的潛能，在一定劑量范圍內(nèi)對(duì)腫瘤細(xì)胞具有一定的選擇性抑制生長(zhǎng)和誘導(dǎo)凋亡的作用而正常細(xì)胞耐受較好。結(jié)腸癌是一種常見(jiàn)的惡性腫瘤，在我國(guó)的發(fā)病率呈上升趨勢(shì)，本文利用多種體外培養(yǎng)的結(jié)腸癌細(xì)胞系和裸鼠結(jié)腸癌移植瘤模型證明超營(yíng)養(yǎng)劑量的亞硒酸鈉在體內(nèi)體外均能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。亞硒酸鈉誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的機(jī)理目前仍不很清楚，本文研究了Bcl—2家族蛋白在亞硒酸鈉

2、誘導(dǎo)凋亡過(guò)程中發(fā)揮的作用，并進(jìn)一步分析了亞硒酸鈉誘導(dǎo)Bax激活的分子機(jī)制。 通過(guò)多種細(xì)胞凋亡檢測(cè)技術(shù)，在SW480、HCT116、HT29三種結(jié)腸癌細(xì)胞系中證明5—10μM亞硒酸鈉能誘導(dǎo)典型細(xì)胞凋亡，并誘發(fā)細(xì)胞色素C從線粒體釋放至胞漿，說(shuō)明內(nèi)源性線粒體凋亡通路被激活。Bcl—2家族蛋白是重要的細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)因子，其與線粒體凋亡通路具有密切聯(lián)系，在SW480細(xì)胞凋亡的研究中發(fā)現(xiàn)亞硒酸鈉能誘導(dǎo)Bax從胞漿轉(zhuǎn)位至線粒體，本文主要研究Ba

3、x這個(gè)關(guān)鍵分子在亞硒酸鈉誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡中的作用。將GFP標(biāo)記的Bax在SW480細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)，構(gòu)建了可實(shí)時(shí)觀察Bax功能狀態(tài)變化的細(xì)胞模型。利用這個(gè)模型，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)亞硒酸鈉誘導(dǎo)了Bax構(gòu)象變化、遷移至線粒體、多聚體形成和細(xì)胞色素C釋放這一系列事件，并明確了這些事件的先后順序。在此體系中高表達(dá)抗凋亡Bcl—2家族成員Bcl—xL能顯著抑制亞硒酸鈉誘導(dǎo)的Bax構(gòu)象變化、遷移至線粒體、多聚體形成和細(xì)胞色素C釋放。在明確亞硒酸鈉激活Bax這一現(xiàn)

4、象之后，利用基因缺失的細(xì)胞模型分析了Bax對(duì)于亞硒酸鈉誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的重要性。Bax/Bak雙缺失的MEF細(xì)胞與野生型MEF細(xì)胞相比對(duì)亞硒酸鈉誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡具有很強(qiáng)抗性，Bax單缺失的HCT116結(jié)腸癌細(xì)胞與野生型HCT116細(xì)胞相比對(duì)亞硒酸鈉誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡敏感性降低，說(shuō)明Bax是亞硒酸鈉誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的重要介導(dǎo)分子。 本文進(jìn)一步分析了亞硒酸鈉誘導(dǎo)Bax激活的分子機(jī)制，發(fā)現(xiàn)在SW480細(xì)胞中亞硒酸鈉能誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)ROS水平持續(xù)性升高。

5、在穩(wěn)定表達(dá)GFP—Bax的SW480細(xì)胞中，MnSOD活性類似物MnTMPyP能抑制亞硒酸鈉誘導(dǎo)的Bax激活，而GSH前體NAC和GSH耗竭劑BSO兩種化合物在促進(jìn)亞硒酸鈉誘導(dǎo)的ROS水平升高的同時(shí)也促進(jìn)Bax激活。在尋找亞硒酸鈉誘導(dǎo)Bax激活的線索過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)通過(guò)氧化應(yīng)激使Bim表達(dá)上調(diào)可能是Bax激活的機(jī)制之一。除此之外，進(jìn)一步利用Biotin標(biāo)記的巰基修飾劑檢測(cè)Bax氧化還原狀態(tài)發(fā)現(xiàn)，亞硒酸鈉在SW480細(xì)胞中能誘導(dǎo)Bax自由巰基

6、氧化，而MnTMPyP能抑制Bax巰基氧化。這些現(xiàn)象提示亞硒酸鈉可能通過(guò)內(nèi)源性ROS直接改變Bax的氧化還原狀態(tài)，其中半胱氨酸的修飾可能發(fā)揮了關(guān)鍵作用。利用定點(diǎn)突變技術(shù)，構(gòu)建了Bax序列上兩個(gè)保守半胱氨酸位點(diǎn)突變的表達(dá)載體(C62/126SGFP—Bax)，并與野生型GFP—Bax—樣在SW480細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)，實(shí)時(shí)比較野生型和突變體Bax對(duì)亞硒酸鈉反應(yīng)的差別。62/126位半胱氨酸突變抑制了亞硒酸鈉和H2O2誘導(dǎo)的Bax構(gòu)象變化、遷移

7、至線粒體、多聚體形成和細(xì)胞色素C釋放，但不能抑制DNA拓?fù)涿敢种苿〦toposide和Camptothecin誘導(dǎo)的Bax激活和細(xì)胞色素C釋放。這些結(jié)果提示亞硒酸鈉可能通過(guò)內(nèi)源性ROS介導(dǎo)改變62/126位半胱氨酸的氧化還原狀態(tài)，誘導(dǎo)Bax構(gòu)象變化而使其激活。 5—10μM亞硒酸鈉在體外雖能顯著誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡，但對(duì)原代培養(yǎng)的人胚胎腸粘膜上皮細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)作用較弱。進(jìn)一步建立了結(jié)腸癌動(dòng)物模型，在整體動(dòng)物水平觀察亞硒酸鈉對(duì)結(jié)腸癌的